- 刘昊泽;张善林;马微;王雨焜;苑红;兰铮;霍达;闫思睿;张浩楠;扈瑞平;马春丽;
目的 探讨螺旋藻藻蓝蛋白对乙醇致氧化应激小鼠抗氧化能力的影响。方法 将48只雌性KM小鼠随机分为空白、模型、低剂量、高剂量组，每组12只。低、高剂量组小鼠经灌胃分别给予藻蓝蛋白0.15和0.30 g/kg体质量，1次/d，连续灌胃42 d，称量小鼠体质量；末次灌胃后禁食16 h（过夜），1次性灌胃50%乙醇，12 mL/kg体质量，模型组小鼠仅进行50%乙醇灌胃，空白组不灌胃。6 h后经摘眼球采血，分离血清，相应试剂盒检测8-表氢氧异前列腺素（8-isoprostane）含量。无菌取各组小鼠肝组织，经研磨离心后，取上清，相应试剂盒检测蛋白质羰基、谷胱甘肽抗氧化酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）含量，并分析小鼠体质量与GSH的相关性。结果 与空白组比较，模型组小鼠体质量增加，但差异无统计学意义（F=1.585,P> 0.05）；血清中8-isoprostane、肝组织中蛋白质羰基和GSH含量均显著升高（F分别为11.697、13.582、17.213,P均<0.05）；肝组织中GSH-Px含量下降，但差异无统计学意义（F=5.978,P> 0.05）。与模型组比较，低、高剂量组小鼠体质量明显下降（F分别为4.125和18.842,P均<0.05）；血清中8-isoprostane及肝组织中蛋白质羰基含量均明显降低（F=10.695～40.512,P均<0.01）；肝组织中GSH-Px和GSH含量均显著提高（F=42.654～76.379,P均<0.01）。小鼠肝组织中GSH含量与小鼠体质量呈负相关（R2=0.013 49,P> 0.05）。结论 藻蓝蛋白可降低乙醇至氧化应激小鼠的氧化损伤，提高抗氧化能力，同时可降低小鼠体质量。
2023年11期 v.36 1301-1305页 [查看摘要][在线阅读][下载 890K] [下载次数：400 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘晓丽;闫干干;闫浩浩;刘志成;刘晓平;陈云雨;
目的 在大肠埃希菌（E.coli）中表达登革病毒（dengue virus,DENV）NS2B-NS3蛋白酶，对表达条件进行优化，并测定酶活性，为抗DENV药物先导化合物的筛选与发现奠定基础。方法 将密码子优化的NS2B-NS3基因连接到pET-28a载体中，构建重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3，转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导NS2BNS3蛋白酶表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度，确定NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件。使用HisTrap~(TM)亲和层析柱分离纯化NS2B-NS3蛋白酶，通过荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）试验测定酶活性。结果 重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3经双酶切（NheⅠ/XhoⅠ）及测序证明构建正确。NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件为：诱导温度20℃，诱导时间10 h,IPTG浓度0.2 mmol/L，表达量达20 mg/L。纯化的NS2B-NS3蛋白酶纯度大于90%，可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合，且具有良好的水解活性，其比活力为16 111 U/mg、米氏常数（K_m）值为16.46μmol/L、催化常数（k_(cat)）值为0.028/s。结论 成功制备了高纯度、高活性的DENV NS2B-NS3蛋白酶，为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立奠定了实验基础。
2023年11期 v.36 1306-1312页 [查看摘要][在线阅读][下载 1194K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 池奋清;秦轲茹;张宏伟;于保锋;
目的 对SLC33A1基因的理化性质、结构功能、蛋白相互作用以及不同物种间的同源性进行生物信息学预测分析，为SLC33A1功能的进一步研究提供参考。方法 利用多种不同的生物信息学工具，对SLC33A1基因的理化性质、亲疏水性、信号肽结构、跨膜结构、亚细胞定位、三维空间结构、翻译后修饰位点、蛋白相互作用等进行预测分析。结果 SLC33A1蛋白是一种中性稳定蛋白，具有疏水性，不存在信号肽序列，主要分布于细胞膜及膜结构细胞器，在囊泡膜的概率为13.0%;SLC33A1蛋白序列有11个跨膜结构域，6个胞外结构域，6个胞内结构域；SLC33A1蛋白三级结构弹性较大，空间结构比较稳定，拥有2个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点及13个可能的蛋白激酶磷酸化位点；SLC33A1与ATM等7个蛋白具有高置信度的相互作用关系；SLC33A1主要参与肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)介导的未折叠蛋白应答的负调控、鞘糖脂、唾液酸化、细胞对γ射线的反应、内质网应激反应的负调控等生物学过程。结论 利用多种软件对SLC33A1的性质及功能进行了深入了解，为抗癌新靶点的进一步研究提供了思路及理论支持。
2023年11期 v.36 1313-1318+1323页 [查看摘要][在线阅读][下载 1211K] [下载次数：224 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 曹璟;吴鹏;王斌;曹利维;郭蕊;江砚芳;
目的 评价静注人免疫球蛋白（pH 4）[human immunoglobulin(pH 4)for intravenous injection,IGIV，简称静丙]工艺优化后产品的稳定性。方法 在多批次规模化生产中，采用A滤板和B滤膜分别对不同分离阶段蛋白组分进行过滤，以降低产品中免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)残留量。对成品进行物理（外观、可见异物、不溶性微粒检查及热稳定性试验）、化学检定[蛋白质含量、纯度、分子大小分布、抗-HBs、白喉抗体、激肽释放酶原激活剂（prokallikrein activator,PKA）、抗补体活性（anti-complement activity,ACA）及抗-A和抗-B血凝素抗体效价、IgA残留量]及加速和长期稳定性试验。结果 采用优化工艺生产的静丙关键质量指标与正常工艺生产批次相比，均无明显差异，IgA残留量明显下降（t分别为3.992和11.215,P均<0.05）。加速稳定性和长期稳定性试验工艺优化后的静丙各项检测结果均合格，符合《中国药典》三部（2020版）中相关规定。结论 工艺优化后的静丙在有效降低IgA残留量的基础上，稳定性良好，对于血液制品生产企业提升静丙产品质量具有重要意义。
2023年11期 v.36 1319-1323页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 江思婧;李静;刘畅;牟雁东;
目的 探讨枸杞糖肽（Lycium barbanun glycopeptide,LbGP）对放射诱导人角质形成细胞HaCaT损伤的保护作用及其机制。方法 采用直线加速器（速率6 Gy/min）分别按4、8、12、16、20、24、28 Gy剂量对HaCaT细胞进行照射，CCK-8法检测细胞活性。以0、0.05、0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、3 mg/mL的LbGP作用HaCaT细胞4h，进行12 Gy剂量放射，CCK-8法检测细胞活性。将HaCaT细胞分为空白对照组（不加LbGP不放射）、放射组（12 Gy剂量照射）、LbGP+放射组（0.8 mg/mL LbGP作用24 h,12 Gy剂量照射），照射1 h后，流式细胞术检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生量，WST-8法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，Western blot法检测细胞中核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)、p-Nrf2、NADPH氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达水平；分别于放射1、3、5 h后，qRT-PCR法检测Nrf2、HO-1、NQO1基因mRNA的转录水平。结果 12 Gy放射辐射量可诱导约50%细胞死亡，0.8 mg/mL LbGP对放射细胞活性保护作用最佳。放射1 h后，与空白对照组比较，放射组HaCaT细胞内ROS含量显著增加（F=2.55,P <0.001）,SOD活力显著降低（F=1.23,P <0.01）,NQO1、Nrf2蛋白含量差异无统计学意义（F分别为1.78和1.00,P均> 0.05）,HO-1蛋白含量明显增加（F=1.37,P <0.05）,p-Nrf2蛋白含量显著下降（F=2.75,P <0.01）；与放射组比较，LbGP+放射组HaCaT细胞内ROS含量明显降低（F=3.61,P <0.001）,SOD活性明显升高（F=1.23,P <0.05）,Nrf2,p-Nrf2、HO-1及NQO1蛋白含量均显著上升（F分别为4.00、2.25、6.25及1.27,P均<0.05）。放射1、3、5 h，与放射组比较，LbGP+放射组Nrf2、HO-1、NQO1基因mRNA转录水平均明显升高（F=0.20～36.00,P均<0.05）。结论 LbGP可减轻放射对HaCaT细胞的氧化应激损伤，保护细胞活性，该作用可能是通过激活Nrf2及提高其下游抗氧化酶SOD、HO-1、NQO1水平而发挥作用的。
2023年11期 v.36 1324-1328+1334页 [查看摘要][在线阅读][下载 955K] [下载次数：394 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 徐宏山;黄艳秋;刘欣玉;贾丽丽;李玉华;
目的 采用新一代Illumina/Solexa测序平台对黄热减毒活疫苗（鸡胚细胞）毒种在基因组水平进行质量控制。方法 将黄热减毒活疫苗YF17D-204毒株接种原代鸡胚细胞，筛选鸡胚细胞黄热减毒活疫苗适应株，建立YFV17D-CEC三级毒种库；提取各级毒种病毒基因组RNA，制备RNA文库，采用新一代Illumina/Solexa测序平台进行高通量RNA测序，采用FastQC、Trimmomatic、SPAdes、GapFiller、PrInSeS-G、Prokka、RepeatMasker、CRT、NCBI Blast~+、KAAS、HMMER3、TMHMM,SignalP,LipoP、ProtCamp、MegAlign等生物学软件，对黄热病毒全基因组核酸序列进行基因组系统化分析。结果 YFV17D-CEC三级毒种库全基因组全长为10 862个核苷酸，其中119～10 354位（10 236 bp）为1个开放阅读框，编码3 412个氨基酸。序列比对分析显示，YFV17D-CEC三级毒种库序列与YFV17D RKI(JN628-279.1)、YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax(JX503529.1)YFV17D-204(KF769015.1)同源性均为100%，三级毒种库全基因组未发生突变。比较黄热减毒活疫苗不同疫苗株序列发现，黄热病毒具有多个多态性位点。结论 YFV17D-CEC在原代鸡胚细胞上具有良好的遗传稳定性。利用高通量RNA测序技术可快速检测YFV17D-CEC三级毒种库全基因组信息，序列分析数据可对黄热疫苗毒种库进行基因水平的质量控制。
2023年11期 v.36 1335-1340页 [查看摘要][在线阅读][下载 898K] [下载次数：125 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张文劲;李庆妮;唐定;陈云丰;华婉璐;刘元浪;李新国;卢佳;
目的 建立恒河猴血清SARS-CoV-2变异株特异性IgG抗体的间接ELISA检测方法，并进行验证。方法 以SARS-CoV-2 Beta变异株灭活疫苗为包被抗原建立特异性IgG抗体的间接ELISA检测方法，并优化方法的抗原包被浓度（1、2、4μg/mL）、待检血清稀释度（1∶800～1∶12 800）、PBST封闭液（含1%BSA、2%BSA、1%脱脂奶、2%脱脂奶、1%BSA+1%脱脂奶）、封闭时间（30、60、90 min）、二抗稀释度（1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000）、血清及二抗孵育时间（30、60、90 min）、TMB显色反应时间（5、10、15、20、25、30 min）。采用建立的方法检测60份恒河猴阴性血清，确定阴、阳性临界值。验证该方法的敏感性及精密性。采用建立的方法及微量中和试验分别检测44份恒河猴血清抗SARS-CoV-2 Beta变异株特异性IgG抗体及中和抗体水平，并比较二者的相关性和一致性。结果 确定最佳检测条件：抗原包被浓度为1μg/mL；封闭液为含1%脱脂奶粉的PBST，封闭时间为30 min；待检血清稀释度为1∶1 600，孵育时间为90 min，二抗稀释度为1∶10 000，孵育时间为30 min；底物显色时间为25 min。该方法的阳性临界值为0.093，阴性临界值为0.084，位于两者之间判为可疑。5份阳性血清测得阳性结果的血清稀释倍数均为1∶51 200；精密性验证变异系数（CV）均<15%。44份恒河猴血清IgG抗体效价与中和抗体水平之间呈强相关（r=0.858 0,P <0.000 1）；两种方法总符合率为90.9%，阳性符合率为93.6%，阴性符合率为84.6%；一致性检验Kappa为0.783 8(95%CI:0.586 5～0.981 0)。结论 建立的恒河猴血清SARS-CoV-2变异株特异性IgG抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性和精密性，与微量中和试验具有较强一致性，可用于恒河猴血清IgG抗体的检测。
2023年11期 v.36 1341-1346+1352页 [查看摘要][在线阅读][下载 963K] [下载次数：231 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王玢;徐世友;杨俊杰;周晖国;雷清;
目的 建立用于检测汉逊酵母活性和活力的荧光素二乙酸酯（carboxyfluorescein diacetate,CFDA）-碘化丙啶（propidium iodide,PI）双荧光染色法。方法 通过单因素试验，优化CFDA的染色时间（5、10、20、40、60、120 min）、工作液浓度（50、100、200、300μmol/L）及PI的染色时间（5、10、15、20、25 min）、工作液浓度（2、10、20、30μmol/L）。采用最适条件检测理论存活率为0、25%、50%、75%和100%的汉逊酵母样品，荧光显微镜下观察荧光信号，ImageJ软件分析灰度值；计数存活及死亡细胞个数，计算实际存活率和实际死亡率。同时分析实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值的相关性。采用建立的CFDA-PI双荧光染色法检测3批汉逊酵母培养物的活性及活力。结果CFDA和PI的最佳染色时间为60和5 min，最佳工作液浓度为200和2μmol/L。不同理论存活率汉逊酵母样品的实际灰度值、实际存活率及实际死亡率与相应理论值均具有显著相关性（R~2=0.998 3～0.999 2,P <0.05）。3批汉逊酵母培养物活性及活力3次检测值的CV分别为3.20%～4.03%和1.10%～2.27%。结论 成功建立了用于检测汉逊酵母活性和活力的CFDA-PI双荧光染色法，可用于相关研究中汉逊酵母活性和活力的快速检测。
2023年11期 v.36 1347-1352页 [查看摘要][在线阅读][下载 1016K] [下载次数：267 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 李婉莉;刘英微;李艳;董圆;李爱灵;赵玉秀;
目的 评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine made from Sabin strains,sIPV）制剂处方优化后产品质量。方法 对制剂处方优化（无酚红、无抑菌剂）后sIPV产品进行质量属性评估，并与已上市sIPV产品进行质量可比性分析；将制剂处方优化前后成品同时肌内免疫270只Wister大鼠（雌雄各半），检测大鼠血清中和抗体水平，进行免疫原性评价和可比性分析；将制剂处方优化后成品分别置37℃、室温（20～25℃）和2～8℃进行加速和长期稳定性试验，检测关键指标D抗原含量，进行稳定性评价，并与已上市产品历史数据进行可比性分析。结果 制剂处方优化后的sIPVⅠ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量、蛋白质含量、pH、Vero细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、游离甲醛含量等各项检定结果均符合《中国药典》三部（2020版）要求和企业标准，工艺优化前后质量属性一致，免疫原性一致，加速及长期稳定性趋势一致。结论 制剂处方优化后的sIPV不再含有酚红和抑菌剂成分，制剂安全性得到提升；与优化前相比，产品质量属性、免疫原性及稳定性高度相似；产品有效期内各项指标均符合要求，且具有良好的稳定性。
2023年11期 v.36 1353-1360页 [查看摘要][在线阅读][下载 1218K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王吉;王莎莎;李威;付瑞;谭淑萍;范婷婷;郑立群;刘志坚;汤华东;万滔;岳秉飞;
目的 建立8种鼠源性病毒的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,Q-PCR)检测方法，并进行验证。方法 通过4个实验室验证Q-PCR法的特异性、灵敏度及精密性，同时进行病毒模拟污染试验及盲样检测，并将检测结果进行比对。采用Q-PCR法检测26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品。结果 用于8种鼠源病毒检测的Q-PCR法与同科同属或其他鼠源病毒无交叉反应；除实验室2对鼠痘病毒（又名脱脚病病毒）（ectromelia virus,EctV/Mouse Pox,MPV）检测的灵敏度为2×10~2copies/μL外，实验室2对其他7种病毒及其他3个实验室对8种鼠源性病毒的检测灵敏度均为2×10~1copies/μL；除实验室3对鼠腺病毒（mouse adenovirus,MAdV）检测拷贝数试验间CV为37.58%外，实验室3对其他7种病毒和其他3个实验室对8种病毒检测的试验内、试验间Ct和拷贝数CV均<25%。病毒模拟污染试验检测灵敏度均符合参数要求；4个实验室盲样检测结果符合率为100%。26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品8种鼠源病毒检测结果均为阴性。结论 鼠源性病毒的Q-PCR法具有良好的特异性、灵敏度及精密性，可用于鼠源性生物制品的检测。
2023年11期 v.36 1361-1367+1372页 [查看摘要][在线阅读][下载 1023K] [下载次数：257 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 郑巧鑫;苏欣;魏淑贞;刘诗怡;罗晶;黄颖;苏会岚;李娜;
目的 分离提取非小细胞肺癌A549细胞培养上清液中的外泌体，并进行鉴定。方法 分别采用超速离心法（ultracentrifugation,Ult）及改良法[即Ult法结合试剂盒Exo QuickTM(Ult-Exo QuickTM,U-EQ)]分离提取非小细胞肺癌A549细胞培养上清液中的外泌体。BCA法测定外泌体浓度，纳米粒子追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒径分布，荧光染色及透射电镜（transmission electron microscope,TEM）法观察外泌体的形态，Western blot法检测外泌体表面CD63和HSP70蛋白的表达情况。结果 U-EQ及Ult法分离提取外泌体的浓度分别为1.355和0.909 mg/mL；颗粒总数分别为4.65×10~9和4.06×10~9粒/mL，峰值尺寸分布范围分别为81.5～165.5和59.5～176.5 nm，平均尺寸分别为（152.3±8.8）和（94.3±9.8）nm；直径均为30～150 nm,U-EQ法分离提取外泌体的形态更均一；均可见CD63和HSP70蛋白表达，U-EQ法分离提取的外泌体蛋白表达量更高。结论 U-EQ及Ult法均可从非小细胞肺癌A549细胞培养上清中分离提取外泌体，U-EQ法提取外泌体的浓度更高，粒径更均一。
2023年11期 v.36 1368-1372页 [查看摘要][在线阅读][下载 936K] [下载次数：407 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 赵芳圆;杜瑞晓;李世慧;
目的 对组分百日咳疫苗中间产品的蛋白含量检测方法-Lowry2法[《中国药典》三部（2020版）福林酚法-第二法]进行适用性验证。方法 标准品和样品经脱氧胆酸盐-三氯乙酸沉淀预处理去除杂质，随后与福林酚反应，在750 nm波长处测定吸光度值。以标准品浓度-吸光度绘制标准曲线，计算样品浓度。对该方法进行专属性、线性、准确性、精密性验证；并采用该方法检测3批组分百日咳疫苗中间产品的蛋白含量。结果 该方法检测中间产品背景缓冲液蛋白含量与超纯水比较，差异无统计学意义（t=0.277～1.178,P=0.304～0.795）；蛋白浓度在0～50μg/mL之间标准曲线线性关系良好，R~2均> 0.98；准确性验证加标回收率在90%～110%之间；重复性及中间精密性验证的RSD均<3%。3批组分百日咳疫苗中间产品蛋白含量检测结果均符合企业内部《制造与检定规程》要求。结论 Lowry2法专属性、准确性、精密性良好，可用于测定组分百日咳中间产品的蛋白含量，为Lowry2法的适用性提供了依据。
2023年11期 v.36 1373-1377页 [查看摘要][在线阅读][下载 867K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 徐世友;易中恒;张婷婷;郭济中;张旭东;焦磊;雷清;
目的 采用人工神经网络（artificial neural network,ANN）优化一种可获得高生物量及菌体活力大肠埃希菌（E.coli）的摇瓶培养基。方法 以葡萄糖（glucose,Glu）、酵母浸出物（yeast extract,YE）、酵母蛋白胨（yeast peptone,YP）、大豆蛋白胨（soy peptone,SP）和酵母基础氮源（yeast nitrogen base,YNB）占比为混料分量，菌体悬浮液A_(600)(A1)、培养物湿菌重（G,g/L）和菌体活力指标值（A2,A_(460)）为响应值，采用混料设计试验筛选对响应值具有显著影响的混料分量。以混料设计试验结果为训练和验证数据样本构建ANN模型，输入变量为混料分量且约束同混料分量上下限，输出变量为混料设计响应值。通过所构建ANN获得的优化后培养基配方和参考值，应用蒙特卡洛模拟进一步调整培养基配方，并获得E.coli摇瓶培养基配方，再对培养基配方进行10次验证试验。结果 E.coli摇瓶培养基配方：Glu 26 g/L、SP26 g/L、YNB 13 g/L，培养基总浓度为65 g/L。验证结果为：培养可获得A1≥14的批次几率为60%,G≥77 g/L的批次几率为50%,A2≥11的批次几率为40%。培养结果数据均值与参考值均等价。结论 本研究优化获得的E.coli摇瓶培养基可培养获得高生物量及菌体活力的E.coli。
2023年11期 v.36 1378-1382+1390页 [查看摘要][在线阅读][下载 1000K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]