- 潘亚菲;赵志军;党甜甜;康宇婷;贾伟;
目的 探讨过表达OXA-48对菌株耐药性、适应性及宿主细胞Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）信号通路的影响。方法 将重组质粒pET32a(+)-OXA-48转化至E.coli BL21(DE3)中，获得的重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)进行菌落PCR及测序鉴定。以A_(600)(0.3、0.5、0.7)、IPTG终浓度（0.4、0.6、0.8 mmol/L）及诱导时间（2、4、6 h）为变量，mRNA转录水平为响应值，设计3因素3水平正交试验，优化质粒的诱导表达条件。纸片扩散法检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对亚胺培南（Imipenem,IPM）、美罗培南（Meropenem,MEM）、头孢曲松（Ceftriaxone,CRO）、头孢吡肟（Cefepime,FEP）的耐药性；通过生物膜形成试验和血清抵抗力试验检测重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)的适应性。将pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)、pET32a(+)-BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)菌株分别感染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,qRT-PCR法检测细胞中TLR2、TLR4和NF-кB(p65)基因mRNA转录水平，ELISA法检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达情况。结果 经菌落PCR及测序鉴定，重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)构建正确。最佳诱导条件：A_(600)为0.3,IPTG终浓度为0.6 mmol/L，诱导时间为2 h。与pET32a(+)-BL21(DE3)菌株比较，重组菌pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)对IPM、MEM、CRO和FEP 4种抗生素的耐药性明显降低（t=7.14～22.32,P均<0.05），形成的生物膜明显增多（t=15.69,P <0.05），在血清中的存活率显著升高（P <0.05）;pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞24 h后，TLR2基因mRNA转录水平显著增加（t=5.77,P <0.05），感染12及24 h后，TLR4、NF-кB(p65)基因mRNA转录水平显著增加（t=3.71～10.06,P <0.05）。与正常细胞组相比较，pET32a(+)-OXA-48-BL21(DE3)感染MH-S细胞6、12和24 h后，IL-6及TNF-α的表达水平显著升高（t分别为7.90～13.44及5.40～6.32,P均<0.01）,IL-10表达水平显著下降（t=3.15～4.08,P均<0.05）,TGF-β的表达水平差异无统计学意义（t=0.013～1.41,P均> 0.05）；感染12和24 h时，IL-6表达水平显著高于pET32a(+)-BL21(DE3)组（t分别为2.92和3.79,P均<0.05）。结论 过表达OXA-48可降低细菌的耐药性，提高适应性及宿主细胞TLRs信号通路相关因子的转录水平，还可影响宿主细胞下游细胞因子的表达水平。
2023年09期 v.36 1032-1038页 [查看摘要][在线阅读][下载 982K] [下载次数：77 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 龙明望;王涵;张丽;贾凡;刘燕会;宁雪磊;陈俊英;潘玥;孙强明;
目的 在急性单核细胞白血病细胞（THP-1）水平建立Ⅲ型登革病毒（Dengue virus typeⅢ，DENV-3,DV-3）感染和抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement,ADE）感染模型，探讨胞内长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的差异性表达，绘制竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,CeRNA)调控网络并进行LncRNA翻译功能预测。方法 DENV-3感染C6/36细胞6 d后，收获培养上清，采用CCID50法测定病毒滴度，并通过PCR进行型别以及基因组全长扩增鉴定；扩增DENV-3标准质粒，PCR鉴定，绘制标准曲线；将THP-1细胞分为阴性对照（THP-1）、直接感染（DV-3）、ADE及空白对照[1640（-）]组，感染48 h后提取胞内总RNA，测定病毒拷贝数；通过全转录组测序技术，对THP-1 vs DENV-3、THP-1 vs ADE、DENV-3 vs ADE各组中上调和下调前5个的LncRNA进行CeRNA调控网络构建，并分析其编码蛋白的功能。结果 DENV-3感染C6/36细胞3 d后有明显的细胞融合、空泡和脱落；病毒滴度约为1.0×104.64PFU/mL,PCR特异引物鉴定为DENV-3，获得病毒完整的基因序列；ADE组胞内病毒核酸拷贝数明显高于DV-3组和空白对照组；在THP-1 vs DENV-3中，预测到人细胞黏附蛋白相互作用蛋白（cytohesin interacting protein,CYTIP）的表达量出现上调；在THP-1 vs ADE中，预测到驱动蛋白家族成员5A(kinesin family 5A,KIF5A)的表达量下调；在DENV-3 vs ADE中，预测到簇分化抗原9(cluster differentiation antigen 9,CD9)和胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)的表达量上调。这些差异性的LncRNA均具有开放阅读框（open reading frame,ORF），除了Lnc-SH3BP1和Lnc-RPL41以外，其余的LncRNA均具有内部核糖体结合位点（internal ribosome binding site,IRES）。结论 在DENV-3感染THP-1细胞及其介导的ADE感染中，LncRNA的表达发生了明显的差异性改变，且可能通过多种生物学功能调控感染的进程，有助于更深层次理解ADE感染的发生机制。
2023年09期 v.36 1039-1046+1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1046K] [下载次数：124 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 孙赫;王瑜;蔄弘扬;邱玥;田园;李泽鸿;岳玉环;
目的 评价一种真核表达的抗H5N1-M1入胞单分子抗体（TAT-ScFv-mFc）的生物活性。方法 采用Western blot法及局域表面等离子共振技术（localized surface plasmon resonance,LSPR）分别检测TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白的免疫结合活性及亲和力；CCK-8法检测TAT-ScFv-mFc对流感病毒H1N1的抑制作用；免疫荧光法检测TAT-ScFv-mFc对MDCK细胞的穿膜能力。雌性BALB/c小鼠尾静脉注射TAT-ScFv-mFc,200μL/只，共30只，于注射后5、60、120、240及360 min，断尾采血，分离血清，ELISA法检测血清效价，根据Origin 2021软件绘制的半衰期曲线计算半衰期。结果 TAT-ScFv-mFc与H5N1-M1蛋白可发生特异性结合，结合数率常数（Ka）达6.67×10~4[1/（M*s）]。经H1N1感染的MDCK细胞的存活率随着TAT-ScFv-mFc浓度增加而逐渐升高，且呈剂量依赖性，对H1N1的复制有明显抑制作用。TAT-ScFv-mFc可在短时间内穿过MDCK细胞膜，进入细胞内，结合病毒M1蛋白，从而抑制病毒的复制和组装。TAT-ScFv-mFc在小鼠体内的半衰期为212 min。结论 TAT-ScFv-mFc具有与H5N1-M1良好的免疫结合活性及亲和力，可有效抑制H1N1的复制，对MDCK细胞膜有良好的穿透能力，且在小鼠体内半衰期较长，为H5N1感染的药物治疗、疫苗研究、预防治疗奠定了基础。
2023年09期 v.36 1047-1053页 [查看摘要][在线阅读][下载 1020K] [下载次数：57 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 牛宇辉;李洪珊;李殿玉;吴贝;李向茸;冯若飞;
目的 在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中高效表达人血清白蛋白（human serum albumin,HSA），并优化其培养工艺，为HSA的规模化生产奠定基础。方法 利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体，并将其电转染至全悬浮CHO细胞中，利用G418及有限稀释法筛选获得可稳定高表达HSA的单克隆细胞株，通过在基础培养基中添加葡萄糖、丁酸钠及补料培养基等方式进行细胞培养工艺优化，以提高HSA表达量；最终在5 L生物反应器上进行放大培养验证。结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-HSA，并在全悬浮CHO细胞中实现分泌表达后，又经过2次单克隆筛选，获得高表达HSA的2次单克隆细胞株CHO-rHSA-7H2A9和CHO-rHSA-7H2D12，表达量分别达到29.37和25.26 mg/L；通过培养工艺优化使HSA表达量达到100.00 mg/L左右；最终使5 L生物反应器上HSA表达量提升至166.16 mg/L，与第1次单克隆细胞上清中HSA表达量相比，提高了30倍左右。结论 实现了HSA在CHO细胞中的高效表达，为进一步在生物制品领域规模化生产HSA及解决市场供应问题奠定了基础。
2023年09期 v.36 1054-1061+1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1069K] [下载次数：601 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 朱艳慧;杨芳芳;王鑫;邢雅玲;刘雅琳;
目的 探讨LRRC23(leucine rich repeat containing 23)激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响。方法 通过在A549细胞中过表达和敲低LRRC23，探讨其对流感病毒复制的影响。将pcLRRC23质粒和siLRRC23(small interfering LRRC23)分别转染A549细胞，24 h后感染A/京防/1/86(H1N1)，空斑试验和ELISA法分别检测细胞上清中流感病毒滴度和HA蛋白表达水平；qRT-PCR和Western blot法分别检测LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS、流感病毒M1基因及HA蛋白的表达水平；免疫荧光和免疫共沉淀试验（co-immunoprecipitation,Co-IP）检测LRRC23与RIG-Ⅰ的相互作用；双荧光素酶报告基因分析试验检测IFN-β-luc和NF-κB-luc活性。结果 过表达LRRC23可显著降低流感病毒A549细胞上清中流感病毒滴度，抑制HA蛋白的表达。过表达LRRC23通过激活RIG-Ⅰ-MAVS信号通路，增强流感病毒刺激的IFN-β和NF-κB激活，抑制流感病毒M1基因和HA蛋白的表达。相反，敲低LRRC23可增加流感病毒感染A549细胞上清中HA蛋白的表达；上调流感病毒M1基因相对表达量，下调RIG-ⅠmRNA和MAVS mRNA相对表达量。结论 LRRC23通过激活RIG-Ⅰ信号通路抑制流感病毒复制，在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。
2023年09期 v.36 1062-1071页 [查看摘要][在线阅读][下载 1031K] [下载次数：237 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 唐姣连;张晓琳;张志磊;南巍巍;薛丽;蒋海燕;张桢;孙强明;蒋鸿超;
目的 分析2018年云南省17株引起手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）与疱疹性咽峡炎（herpangina,HA）的柯萨奇病毒A6型（Coxsackievirus A6,CVA6）全基因组特征，了解不同致病CVA6之间的基因差异。方法随机抽取昆明市儿童医院2018年临床诊断为HFMD与HA的1 909份粪便样本，使用肠道病毒A组通用引物进行检测并筛选CVA6阳性样本。用CVA6全基因组引物进行序列扩增，经BioEdit软件拼接后获得CVA6全基因序列，应用BioEdit、MEGA 7.0、Simplot、Heml 1.0及Phyre2等软件分析CVA6全基因组特征。结果 筛选出CVA6阳性样本929份，获得CVA6全基因序列17株（其中9株临床诊断为HFMD,8株临床诊断为HA）;17株CVA6在全基因系统进化树上均处于Ⅳ型分支；HA、HFMD代表株未发生明显重组，但在非结构蛋白3D区发生变异；HFMD、HA代表株在VP1的S597T、Q705L和Q663L位点存在差异，在线预测分析发现其VP1二级结构与CVA6原型株一致，未发生改变。结论引起HFMD与HA的17株CVA6之间具有较高的基因组同源性，同时也存在核苷酸及氨基酸差异，这种变化可能对CVA6的复制及适应性产生影响。
2023年09期 v.36 1072-1079页 [查看摘要][在线阅读][下载 1400K] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 阮瑶;丁宁;于军;
目的 探讨ELP_(30)-intein标签在重组脂蛋白相关磷脂酶A_2(lipoprotein-associated phospholipase A_2,LP-PL A_2)原核表达过程中的作用。方法 将重组质粒pIG6-ELP_(30)-intein-LP-PL A_2转化至感受态E.coli W3110中，以不携带ELP_(30)-intein标签的重组质粒pIG6-LP-PL A_2为阴性对照，对不同温度（20、25、30℃）及诱导方式（IPTG及自动诱导）下重组ELP_(30)-intein-LP-PL A_2的质周腔表达情况进行Western blot分析。采用基于类弹性蛋白（elastin-like polypeptide,ELP）标签的可逆相变循环（inverse transition cycling,ITC）技术纯化并分离目的蛋白，进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 不携带ELP_(30)-intein标签的LP-PL A_2重组蛋白仅于胞内表达，无法定位于质周腔。在相同诱导温度条件下，自动培养基诱导表达获得的目标蛋白量远低于IPTG诱导表达。与20℃比较，IPTG诱导温度为25及30℃时，目标蛋白总体表达水平有所提升。采用ITC技术成功分离纯化目标蛋白ELP_(30)-intein-LP-PL A_2，通过诱导内含肽自身剪切获得了LP-PL A_2重组蛋白，纯度为70%，且可与抗LP-PL A_2抗体发生特异性结合。结论 ELP_(30)-intein标签可促进重组蛋白LP-PLA_2在E.coli质周腔内的表达，且通过非色谱纯化技术分离获得的LP-PL A_2重组蛋白纯度为70%，为快速、低成本有效生产LP-PL A_2重组蛋白提供了新方法。
2023年09期 v.36 1080-1084+1096页 [查看摘要][在线阅读][下载 832K] [下载次数：88 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 卞琳;高迎真;申柳依;张玲;
目的 检测PLCH1基因在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的变异及表达情况，分析PLCH1在食管癌中的功能，并初步探讨其作用机制。方法 利用GISTIC分析PLCH1在ESCC中的拷贝数变异情况，TCGA数据库及免疫组织化学法检测PLCH1在ESCC与正常食管组织中的表达情况。通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ESCC细胞系中PLCH1的表达情况。采用MTT、克隆形成试验、Transwell法等检测PLCH1沉默对ESCC细胞增殖及迁移能力的影响。结果 PLCH1在ESCC中存在显著的拷贝数扩增（G-scores> 0.1,P <0.05）,ESCC中PLCH1 mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常组织（F=36.00～1 101.00,P均<0.000 1）。PLCH1沉默后，ESCC细胞KYESE180和TE-9的增殖能力、克隆形成能力及迁移能力均显著降低（F=35.49～634.00,P均<0.001）。结论 PLCH1在ESCC中发挥癌基因作用，对ESCC的转移和增殖具有重要意义，可作为ESCC治疗的潜在靶点。
2023年09期 v.36 1097-1104页 [查看摘要][在线阅读][下载 1272K] [下载次数：77 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈仙红;张锐智;穆秋玥;冯军;魏绍峰;雷世光;
目的 评价≥60岁高血压和（/或）糖尿病人群接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗（Vero细胞）后的安全性和免疫原性。方法 于贵州省松桃苗族自治县选择≥60岁高血压、糖尿病患者及健康人群为研究对象，分为高血压组、糖尿病组、合并疾病组（同时患高血压与糖尿病）、健康人群对照组，分别于0、21 d经上臂外侧三角肌肌内注射SARS-CoV-2灭活疫苗（Vero细胞），接种剂量为0.5 mL。记录免疫后≤30 min、0～7 d、8～21 d时间段的不良事件，并随访至接种后6个月。分别于疫苗接种前及接种后28 d，采集受试者静脉血5.0 mL，分离血清，采用细胞病变法检测中和抗体水平，并计算中和抗体几何平均滴度（geometric mean titers,GMT）及抗体阳转率。高血压组及疾病合并组患者分别于每剂接种前、接种后30 min及1～7 d固定时间测量血压；糖尿病组及疾病合并组患者分别于每剂接种前测量1次空腹血糖，接种后当天测量1次餐后2 h血糖，接种后1、3、5、7 d分别检测空腹和餐后2 h血糖。结果 高血压组、糖尿病组、合并疾病组、健康人群对照组征集性不良事件发生率差异无统计学意义（χ2=1.790,P=0.617）；非征集性不良事件的发生率差异无统计学意义（P=0.412）。共发生5例严重不良事件，经判定均与疫苗无关。血压和血糖测定值未见异常波动。高血压组、糖尿病组和合并疾病组率差的95%CI的下限均>-10%，中和抗体GMT率比的95%CI下限均> 0.67，均非劣效于健康人群对照组。结论 ≥60岁高血压和（/或）糖尿病人群接种SARS-CoV-2灭活疫苗（Vero细胞）后具有良好的安全性和免疫原性。
2023年09期 v.36 1105-1110+1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 920K] [下载次数：98 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 单元春;王爽;吴东林;田鑫;程涛;付思美;郭淑英;杨显达;
目的 分析2009—2022年吉林省麻疹流行规律，为制定麻疹防控措施提供依据。方法 采用描述流行病学方法对2009—2022年吉林省麻疹确诊病例的发病率、免疫史及年龄组分布情况进行分析。并对麻疹代表株进行测序，采用生物信息学软件Bioedit和Mega 11分析优势流行株及其变异情况。结果 2009—2022年吉林省共报告麻疹病例6 560例，其中含麻疹成分疫苗免疫史为0剂次及免疫史不详病例分别占50.17%和27.58%。0～24月龄组占总病例数的47.29%，≥15岁组占总病例数的37.41%。报告发病率受免疫策略和新型冠状病毒疫情影响，近3年内达到<1/100万的消除水平。吉林省麻疹病毒优势基因型仍为H1a基因亚型，分子流行病学分析显示有2条大型传播链持续共同流行，其中1条传播链于2015年被阻断。结论 2009—2022年吉林省麻疹报告发病率呈下降趋势，病例年龄呈双向位移分布，集中于无免疫史和免疫史不详人群。应继续提高基础接种率，有针对性地开展强化免疫，加强分子流行病学监测，及时阻断传播链。
2023年09期 v.36 1111-1116页 [查看摘要][在线阅读][下载 1280K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 叶锋;杜秋丽;刘丽娅;马晓菁;谢彩云;谷文喜;马俊杰;易新萍;
目的 对新疆维吾尔自治区（简称新疆）4个地区5种蜱虫宿主动物进行莱姆病流行病学调查，并分析伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的流行基因型。方法 取于新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉及喀什4个地区采集的牛、绵羊、山羊、马和犬血清样本共814份，采用ELISA法测定血清中莱姆病IgG抗体。于上述地区收集蜱虫135只，提取DNA，以其为模板，经巢式PCR法扩增伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA间隔区片段，取阳性样本进行测序。测序结果与GenBank中已登录的伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列进行BLAST比对，并应用MEGA X软件构建系统进化树。结果 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁、昌吉地区血清样本莱姆病IgG抗体阳性率分别为23.6%、2.4%、2.7%和0,4个地区差异有统计学意义（χ2=48.481,P <0.001）；牛、绵羊、山羊、犬和马血清样本的莱姆病IgG抗体阳性率分别为1.1%、4.4%、18.7%、60.5%和0,5种动物差异有统计学意义（χ2=129.03,P <0.001）。135份蜱虫DNA样本中有24份为伯氏疏螺旋体阳性，带菌率约17.78%，包括B.garinii（占比75%）、B.afzelii（占比16.67%）、B.burgdorferi（占比8.33%）3种基因型。结论 新疆乌鲁木齐、喀什、伊犁3个地区的牛、绵羊、山羊和犬4种动物存在莱姆病感染，以B.garinii为主要流行基因型。本研究为新疆地区莱姆病的防控提供了参考。
2023年09期 v.36 1117-1120页 [查看摘要][在线阅读][下载 862K] [下载次数：211 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]