- 李明;房恩岳;刘晓辉;李玉华;
目的 探讨非结构蛋白氨基酸突变（NS1-G53D、NS3-E250V）对登革病毒（Dengue virus,DENV）4型Ban18HK20株增殖及毒力的影响。方法 通过与DENV减毒株（PDK53）进行序列比对，确定Ban18HK20株突变位点；采用同源重组技术构建点突变质粒pSPTM-Ban18HK20(G53D)、pSPTM-Ban18HK20(E250V)、pSPTM-Ban18HK20(G53D+E250V)，酶切及基因测序鉴定点突变质粒；体外转录获得病毒RNA，电转染Vero细胞拯救获得点突变病毒；通过蚀斑试验、间接免疫荧光试验、病毒全基因组测序、生长动力学试验、CCK-8试验和小鼠神经毒力试验对点突变病毒进行生物学特性鉴定。结果 酶切及测序证实点突变质粒构建正确。免疫荧光试验及病毒测序结果显示病毒拯救成功。点突变病毒比母本病毒蚀斑小。Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(E250V)、Ban18HK20(G53D+E250V)的病毒滴度第4天达峰值，分别为7.67、7.84、7.78 LgPFU/mL；母本病毒第5天达峰值，为7.68 LgPFU/mL。Ban18HK20(G53D)感染的BHK21细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高（P=0.003 6）;Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(G53D+E250V)感染的C6/36细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高（P <0.000 1）。点突变病毒与母本病毒对4周龄BALB/c小鼠均无神经毒力；点突变病毒Ban18HK20(E250V)(LD_(50)=8.51 PFU)、Ban18HK20(G53D+E250V)(LD_(50)=0.69 PFU)对3日龄BALB/c乳鼠的神经毒力低于母本病毒（LD_(50)=0.69 PFU）；等量病毒经脑内注射后，点突变病毒Ban18HK20(G53D+E250V)对裸鼠的存活率（60%）高于母本病毒（0）。点突变病毒遗传稳定，在Vero细胞上传至第10代未出现回复突变。结论 非结构蛋白NS1-G53D氨基酸突变减弱了Ban18HK20株对C6/36和BHK21细胞的毒性，双点联合突变可减弱Ban18HK20株在裸鼠体内的神经毒力。本研究为DENV毒力位点研究及疫苗研发奠定了基础。
2023年08期 v.36 902-910页 [查看摘要][在线阅读][下载 933K] [下载次数：269 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 闫甲丽;刘明杨;刘建伟;李素贞;柳森;王健;
目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1)，并进行鉴定。方法 通过2种信号肽[T细胞受体（T cell receptor,TCR）和天然信号肽（nature signal peptide,NSP）]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件（ubiquitous chromatin opening element,UCOE）、PFR]和目的基因rhIFNλ1构建6种信号肽-载体组合的重组质粒，以HEK-293F为宿主细胞，摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1。选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ，瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析（HiTrap SP FF）、蓝胶层析（HiTrap Blue HP）和分子筛凝胶过滤层析（Sephacryl S-100 HR）3步纯化，纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析，并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列。结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定，证明构建正确。随着转染时间的延长，6种表达产物的表达量逐渐增加，转染6 d时最高，达10～20 mg/L。低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定，证明构建正确。重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d，细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800，纯度达97.372%，且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合；反相HPLC检测分析可见2个峰，出峰时间分别为15.6和20.0 min；质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T。结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高，为该蛋白的进一步研究奠定了基础。
2023年08期 v.36 911-917页 [查看摘要][在线阅读][下载 857K] [下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 段慈东;陈毓;宋小军;林珊;金大智;
目的 原核表达具有甲基化酶活性的艰难拟梭菌CamA(Clostridiodies difficile adenine methltransferase A,CamA)蛋白。方法 PCR扩增艰难拟梭菌1870标准菌株CamA蛋白的基因序列，克隆至质粒pGEX-4T-1-MBP中，转化至大肠埃希菌HB101，经1 mmol/L IPTG诱导表达重组目的蛋白，利用Amylose Resin纯化后，CamA蛋白再经烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus,TEV）蛋白酶酶切，采用体外MTase-Glo~(TM)Methyltransferase Assay分析技术验证其甲基化活性。结果 PCR测序结果显示克隆的CamA基因序列正确，未发生碱基突变；重组表达质粒pGEX-4T-1-MBP-CamA经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后显示1 731 bp的CamA基因已连接至载体上；表达的重组蛋白相对分子质量约为108 800（含1个MBP标签），经Amylose Resin纯化后，纯度达90%以上；在20μmol/L DNA和20μmol/L S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）的条件下室温反应30 min,0.5μg CamA能产生浓度约为101.60 nmol/L的S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine,SAH），酶活性为（0.339±0.027）U/mg。结论 成功表达并纯化了艰难拟梭菌CamA蛋白，其具有甲基化酶活性，为后续进一步研究CamA的功能及其在艰难拟梭菌感染发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。
2023年08期 v.36 918-923页 [查看摘要][在线阅读][下载 846K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 肖树;黄晨;马树涛;张凯;李依萌;李真;陆昌瑞;陈婷;
目的 原核表达胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）突变体T142A，并检测其活性。方法 结合多序列比对结果和IDE底物共晶体结构，预测IDE的β6-strand结构中的活性残基。采用点突变技术将IDE的第142位苏氨酸替换为丙氨酸，构建重组质粒ppSUMO-T142A，通过E.coli系统表达后，经镍离子柱亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化，获得突变体T142A，荧光法测定其活性。结果 IDE氨基酸序列在16个物种间高度保守，T142直接参与底物结合，并与底物剪切位点相互作用，且靠近催化活性中心和门亚结构域等重要结构。经测序鉴定，证明重组质粒ppSUMO-T142A突变正确。表达的融合蛋白His-SUMO-T142A相对分子质量约131 000，主要以可溶形式存在于上清中，浓度为18 mg/mL；经3步纯化获得突变体T142A的纯度达86%。T142A催化降解荧光底物Substrate V的最大反应速率（V_(max)）为501.06 min~(-1)，米氏常数（K_m）为9.01μmol/L，与野生型IDE(V_(max)为2 814.32 min~(-1),K_m为11.93μmol/L）比较，活性大幅下降。结论 本研究表达的IDE突变体T142A活性大幅降低，T142是IDE发挥活性功能的重要残基，为新型IDE活性调控分子的研发提供了实验依据。
2023年08期 v.36 924-929页 [查看摘要][在线阅读][下载 936K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李倩茹;周博文;李鑫月;逯静静;徐彬;杨焕民;
目的 探讨冷刺激对小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S细胞）表型的影响。方法 将MH-S细胞置37℃培养24 h，于36、34、32℃分别冷刺激0、0.5、1、3、6、9、12 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白介素-10(interleukin-10,IL-10)基因mRNA转录水平。将MH-S细胞置37℃培养24 h，于34℃冷刺激0.5 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、精氨酸酶（Arginase1,Arg1）基因mRNA转录水平（以冷刺激0 h为对照）；免疫荧光法检测iNOS和Arg1的表达情况（以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照）；Western blot法检测iNOS、TNF-α及核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的表达水平（以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照）。结果 34℃培养0.5 h条件下，MH-S细胞中IL-1β及IL-10基因mRNA转录水平最高，因此采用该条件建立MH-S细胞的冷刺激模型。与0 h比较，34℃培养0.5 h的MH-S细胞中iNOS、TNF-α和Arg1基因mRNA转录水平均明显升高（t分别为3.733、12.190、6.793,P均<0.05）。与阴性对照组比较，刺激组MH-S细胞中iNOS及Arg1的荧光表达强度均有所增强，其中iNOS增强更为明显。与阴性对照组比较，刺激组MH-S细胞中iNOS和TNF-α蛋白表达水平升高，但差异无统计学意义（t分别为0.675和1.514,P均> 0.05）;NF-κB表达水平明显升高（t=3.092,P <0.05）。结论 34℃冷刺激0.5 h可提高MH-S细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α、iNOS、Agr1、NF-κB等炎性相关因子的表达，可激活MH-S细胞中的NF-κB信号通路，诱导炎症蛋白表达，促进细胞活化。
2023年08期 v.36 930-934+940页 [查看摘要][在线阅读][下载 851K] [下载次数：86 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 范培超;路雅菲;刘春雨;马德慧;薛江东;
目的 对2019年通辽地区送检病料进行病原菌分离鉴定，并检测毒力基因分布及致病性。方法 对从2019年通辽地区送检病料中分离到的3株革兰阳性杆菌（FL1、FL2、FL3）进行生化试验、药物敏感性试验、16S rDNA序列分析、毒力基因及致病性检测。结果 生化试验结果显示3株分离菌为蜡样芽胞杆菌；牛源菌株（FL1、FL2）对青霉素及羧苄西林有耐药性，马源菌株（FL3）对头孢拉定有耐药性；FL1、FL2菌株与序列号为KR063181.1（中国湖南株）的蜡样芽孢杆菌亲源性最近，FL3菌株与序列号为HM104658.1（中国山东株）的亲缘性最近，且与FL1、FL2菌株的亲缘性较远；8种蜡样芽孢杆菌毒力基因在3株分离菌中均有分布，4种类炭疽芽孢杆菌毒力基因在3株分离菌中的分布存在差异；3株分离菌均具有致病性。结论 3株分离菌均为致病性蜡样芽胞杆菌，且具有一定的耐药性，牛源与马源蜡样芽孢杆菌在毒力基因分布方面存在差异。
2023年08期 v.36 935-940页 [查看摘要][在线阅读][下载 918K] [下载次数：542 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]
- 李娜;王轲;张培彪;刘忠;张贵民;
目的 对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（human recombinant neutrophil inhibitory factor and hirulog hybrid,TNHH）的处方及工艺进行筛选和优化，并考察其稳定性。方法 以单因素试验结果为依据，pH范围、甘露醇用量、聚维酮K30用量为自变量，高分子蛋白含量为响应值，采用CCF响应曲面设计试验，分析各自变量及其交互作用对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白中高分子蛋白含量的影响，筛选出最优处方。为了方便操作，对最优处方调整后制备中试规模3批样品，分别置于40℃、相对湿度（relative humidity,RH）75%条件下2、4周，2～8℃条件下3、6个月，取样，检测外观、pH、反相高效液相色谱（reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）纯度和体积排阻高效液相色谱（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SECHPLC）纯度，验证该处方和工艺的稳定性。结果 筛选出的最优处方为：pH 4.982 6，甘露醇用量7.986 4%，聚维酮K30用量1.902 7%，最终调整为pH 5.0，甘露醇用量8.0%，聚维酮K30用量2.0%。采用优化处方和工艺制备的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂质量稳定，符合临床用药要求。结论 优选的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂处方工艺合理，适合工业化生产。
2023年08期 v.36 967-972+979页 [查看摘要][在线阅读][下载 813K] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 周志军;陈克金;林连珍;李娟;王敏;陈丽梅;程爽;罗敏华;曾双迎;李陶敬;胡勇;李策生;
目的 优化水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）IgG抗体效价ELISA定量检测方法，进行验证后用于健康人群中高效价VZV-IgG血浆筛选。方法 选用德国维润赛润研发有限公司VZV-IgG间接ELISA试剂盒，将第1代VZV人免疫球蛋白国际标准品（NIBSC编号：W1044）稀释至2 IU/mL作为标准品，采用4参数拟合曲线建立定量ELISA法，确定其最佳线性范围；对优化后的方法进行精密度、准确度验证。用建立的方法检测国药集团武汉血液制品有限公司辖属10个浆站1 962份人血浆样品VZV-IgG抗体效价，以及部分批次人免疫球蛋白制剂。结果 标准曲线线性范围为16.25～2 000 mIU/mL，批内精密度CV为1.3%～10.6%，批间精密度CV为4.270%～7.636%，批内准确度为92.30%～111.02%，批间准确度为98.4%～104.88%；样品添加试验显示，添加样品的实测值为理论值的95.79%～111.03%。1 962份人血浆样本的阳性率为94.29%，效价大于3 000 mIU/mL占比1.02%。不同种类人免疫球蛋白制剂中VZV-IgG抗体效价均较低，且均高于静注人免疫球蛋白（pH 4）。结论 优化后的VZV-IgG定量检测方法可用于健康人群VZV-IgG筛查，自然感染的健康献浆员的VZV-IgG抗体阳性率高，但效价低，需进行疫苗免疫获得合格的高效价血浆。
2023年08期 v.36 973-979页 [查看摘要][在线阅读][下载 811K] [下载次数：421 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 柯晓梅;吴宇曼;孔伟圣;陈智妍;刘帅;吴华佐;朱霞燕;张健;
目的 建立一种用于同时检测多种支原体污染的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法，并进行验证。方法 通过SnapGene软件的多序列比对工具比对13种支原体16S rRNA基因的保守序列，根据保守序列设计2条内引物FIP和BIP、2条外引物F3和B3、环引物LOOP(LF/LB）；建立LAMP体系：Bst DNA聚合酶大片段（8 U/μL）、10×ThermoPoly反应缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L(H_4)_2SO_4,2 mmol/L MgSO_4,0.1%Triton X-100,pH 8.8]、MgSO_4(100 mmol/L）、dNTP Mix、FIP/BIP Primers、F3/B3 Primers、LOOP Primers、无核酸酶水、模板DNA(13种搭载支原体16S rRNA的质粒）。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。验证方法可行性、特异性、可重复性，确定方法检测限。结果 筛选的2组LAMP引物，组合使用可同时检测出11种支原体序列；在其他非特异模板检测中未出现非特异扩增，引物组特异性良好；建立的方法灵敏度好，最低检测限为30.1 copies/μL，且重复性好，未见假阳性和假阴性扩增。结论 LAMP技术可用于检测细胞培养中多种支原体污染的情况，特异性好、耗时短，可作为细胞培养中快速检测支原体污染的技术平台之一。
2023年08期 v.36 980-986页 [查看摘要][在线阅读][下载 969K] [下载次数：239 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李井涛;吴文倩;王月娇;陈良;包小华;
目的 采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC/MSMS）法检测多糖疫苗中十六烷基三甲基溴化铵（cetrimonium bromide,CTAB）残留量，并对测定结果的不确定度进行分析及评定。方法 通过建立数学模型，对检测过程引入的不确定来源和数值进行分析，计算各影响因素的不确定度分量，合成标准不确定度和扩展不确定度，形成不确定度报告。结果 在95%置信区间下，扩展不确定度为0.002 8 mg/kg。多糖疫苗中CTAB残留量测定结果可报告为（1.000 6±0.002 8）mg/kg(k=2，置信区间p=95%)。结论 影响测定结果准确性的主要因素为标准品溶液的配制和回收率的带入，应在实验过程中加以重点关注及控制，使检测结果更可靠。
2023年08期 v.36 987-991页 [查看摘要][在线阅读][下载 867K] [下载次数：97 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 杨柏峰;吴丽洁;刘婷;张娜;李世慧;
目的 建立ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液中十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）残留量的化学显色检测法，并进行验证。方法 以达旦黄为显色剂，建立用于检测CTAB残留量的化学显色法，并对线性范围、中间精密性和准确性进行验证。采用建立的方法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液中CTAB残留量。结果 CTAB标准品在4.0～10.0μg/mL范围内，与A_(500)呈良好的线性关系，R~2> 0.990;3名实验员检测5.0、7.0、9.0μg/mL的CTAB对照品CV均<10%，重复6次检测结果的回收率均在95%～110%之间。ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液中CTAB残留量均<8μg/mL。结论 建立的化学显色法具有良好的线性、中间精密性和准确性，可用于ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液中CTAB残留量的检测。
2023年08期 v.36 992-995页 [查看摘要][在线阅读][下载 806K] [下载次数：79 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ]
- 郝丽坤;宋龙慧;贺文;李宁;
掺杂稀土元素的上转换纳米材料（upconversion nanoparticles,UCNPs）作为新型无机发光材料，因其具有良好的荧光稳定性及生物相容性，并可避免生物材料的自发荧光，在生物传感领域具有明显优势。基于上转换材料的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）体系在生物检测方面的应用也越来越广泛。本文就上述转换材料为基础的FRET体系在生物毒素、激素、蛋白质、核酸、细菌等生物检测方面的应用及未来展望作一综述。
2023年08期 v.36 996-1001页 [查看摘要][在线阅读][下载 811K] [下载次数：501 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 潘丰彦;刘倩倩;刘芳;陈彻;
微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类单链非编码小分子RNA，调控包括肿瘤在内的许多疾病的发病过程。巨噬细胞作为肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中主要渗透免疫细胞，其在肿瘤的起始、血管生成、转移、耐药性等方面均发挥重要作用。miRNAs表达的改变可能会调节巨噬细胞功能，从而影响肿瘤发展过程。本文对miRNAs通过调控巨噬细胞表型和功能从而影响肿瘤进展的相关机制作一综述，为肿瘤治疗提供新的思路。
2023年08期 v.36 1002-1004+1009页 [查看摘要][在线阅读][下载 788K] [下载次数：243 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 童光伟;吴业红;
目前，流感疫苗血凝素（hemagglutinin,HA）含量最常用的检测方法仍为单向免疫扩散法（single-radial immunodiffusion,SRID），但该方法所需标准品制备耗时较长，通常需要2～3个月。在大流行流感发生初期无法获得标准参考品时，如何精确定量分析HA，一直是HA含量检测面临的难题。高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）具有快速、灵敏度高、重复性较好以及准确性高的特点，利用不同的分离原理可快速测定HA含量，在流感疫苗HA含量检测方面已得到很多应用。本文对HPLC在流感疫苗HA含量检测中应用的研究进展作一综述。
2023年08期 v.36 1005-1009页 [查看摘要][在线阅读][下载 785K] [下载次数：382 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 关晓雯;刘萌;魏莲花;
金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的主要原因，其能表达多种细胞壁相关和细胞外毒力因子，因此可引起多种感染性疾病。Ebh蛋白参与金黄色葡萄球菌的黏附、聚集以及生物被膜形成等，这些功能与其强烈的致病性密切相关。金黄色葡萄球菌的致病机制是由不同的双组分信号转导系统和转录调节因子协同控制，其中，ArlRS是黏附、生物膜形成和毒力所必需的关键双组分调节系统（two-component system,TCS）。同时，ArlRS又通过全局调节因子MgrA调控Ebh蛋白，从而影响金黄色葡萄球菌在人类感染性疾病中的作用。本文对其调控机制作一综述。
2023年08期 v.36 1010-1013+1020页 [查看摘要][在线阅读][下载 860K] [下载次数：121 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 何云江;贾伟娟;郗珊珊;王学理;
小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）是一种由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的急性、高度传染性疾病，主要感染山羊和绵羊，发病率和死亡率极高。由于其严重的病理损害及广泛的传播性，给各国养殖业及国际贸易造成巨大经济损失，因此，建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要。本文就用于PPRV检测的普通RT-PCR、普通多重PCR、实时荧光定量PCR(real-time fluorence quantitative PCR,RT-qPCR)、焦磷酸光化测序、巢式PCR(nested PCR,nPCR)、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）等生物检测技术的研究进展作一综述，以期为科学检测、鉴定PPRV提供依据和思路。
2023年08期 v.36 1014-1020页 [查看摘要][在线阅读][下载 827K] [下载次数：186 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]