- 李婧妍;蔡路奎;马艳;温嘉纳;胡文著;廖宏玮;史荔;杨净思;
目的 评价皮内免疫（intradermal,ID）部分剂量组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗（diphtheria-tetanus-acellular component pertussis and Sabin-derived inactivated poliovirus vaccine,DTacP-sIPV）的免疫持久性。方法将40只Wistar大鼠（雌雄各半）分别经ID部分剂量（DTacP-sIPV 1/5和1/10剂量，即1/5D和1/10D ID组）及肌肉注射（intramuscular,IM）全剂量DTacP-sIPV（全剂量IM组），同时设空白对照组（ID PBS）。于0、1、2月共免疫3次，末次免疫后12个月经尾静脉采血，分离血清。微量中和试验法检测抗脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度，间接ELISA法检测大鼠血清中抗白喉毒素（diphtheria toxin,DT）、破伤风毒素（tetanus toxin,TT）、百日咳毒素（pertussis toxin,PT）、丝状血凝素（filamentous haemagglutinin,FHA）和百日咳黏附素（pertactin,PRN）的IgG抗体滴度，并计算抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）及抗体阳性率。末次免疫后12个月，经雾化吸入百日咳杆菌气雾进行攻击，攻击时间为30 min，于气雾攻击后2、5、14 d检测各组大鼠白细胞数及肺、气管、鼻部位的菌落克隆形成数（colony-forming unit,CFU）。结果 与全剂量IM组比较，1/5D和1/10D ID组脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体阳性率差异均无统计学意义（P均> 0.05），空白对照组各型抗体阳性率均为0。1/5D、1/10D ID及全剂量IM组DT、TT、PT、FHA和PRN的IgG抗体阳性率均为100%，空白对照组IgG抗体阳性率均为0。与攻击后2 d比较，空白对照组大鼠经百日咳杆菌气雾攻击后5 d的白细胞数明显升高（F=3.48,P <0.05），随后开始下降；其他组均随时间的延长保持平稳（F=0.14～1.30,P> 0.05）。气雾攻击后，空白对照组大鼠肺部细菌载量明显高于其他3组（F=19.00～206.00,P <0.05），攻击后14 d仍可检测到百日咳杆菌；除空白对照组外，其他3组大鼠肺部细菌载量均于攻击后5 d达峰值，14 d时基本清除，各时间点组间差异无统计学意义（F=1.14～1.25,P> 0.05）。空白对照组各时间点气管和鼻部细菌载量略高于其他组，但差异均无统计学意义（F=0.71～3.54,P> 0.05）；除空白对照组外，其他3组大鼠气管和鼻部细菌载量较接近，差异均无统计学意义（F=0.75～3.41,P> 0.05）。结论 ID 1/5D DTacP-sIPV可诱导大鼠产生针对疫苗各组分的持久保护性抗体，本研究为ID部分剂量DTacP-sIPV免疫策略的制订提供了实验依据。
2023年05期 v.36 513-517+523页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K] [下载次数：168 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李漂;刘艳红;刘晓琳;杨艾;张茜;鲁卫东;
目的 检测电荷修饰脂质体的理化性质，并评价其作为流感疫苗佐剂的免疫增强效果。方法 以大豆卵磷脂、胆固醇、2,3-二油氧基丙基-三甲基氯化铵[N-1-(2,3-Dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylam-moniumchloride,DOTAP]与1,2-二油酰基磷脂酰胆碱（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC）(DOTAP与DOPC质量比为1∶4、2∶3、3∶2、4∶1)为膜材，制备4种电荷修饰的脂质体。将四价流感疫苗分别与制备的4种脂质体按1.4∶1.0的体积分数混合，通过冻融-冻干法将混合液制备为阳离子修饰的流感疫苗脂质体冻干粉。用PBS复溶脂质体冻干粉，采用激光粒度仪测定粒径及Zeta电位，Lowry法测定脂质体包封率。将231只雌性KM小鼠随机分为阴性对照组（PBS）、阳性对照组（四价疫苗原液）、阳离子脂质体组（4种电荷修饰的流感疫苗脂质体）和中性脂质体组（未经电荷修饰的流感疫苗脂质体），均经腹腔注射，0.2 m L/只，免疫后7、14、28 d，采用MTT法和T淋巴表面标记法评价其细胞免疫效果；免疫后3、7、14、28、42、56 d，采用血凝抑制（hemagglutinin inhibition,HI）试验评价其体液免疫效果。结果 DOTAP与DOPC质量比为4∶1时，阳离子修饰脂质体的粒径和Zeta电位达最大，分别为529.65 nm和12.05 mV，此时包封率也较高，为81.82%。4个比例的阳离子脂质体组小鼠脾细胞的刺激指数（stimulus index,SI）及CD4~+/CD8~+值均明显高于阴性对照组（F=4.651～25.866,P均<0.05），其中4∶1比例组的两项指标均高于其他3个比例组；且该组小鼠于免疫后3 d即产生了早期体液免疫效果，免疫后42 d抗体滴度达最高，在整个免疫周期内均维持较高水平。结论 不同电荷修饰的阳离子脂质体均能提高流感疫苗的免疫效果，其中DOTAP与DOPC质量比为4∶1时的免疫增强效果最好，免疫效应持续时间最长。
2023年05期 v.36 518-523页 [查看摘要][在线阅读][下载 846K] [下载次数：193 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 赵丹莹;周永飞;徐艳玲;陈子杨;唐剑光;常东英;王艺博;关诗宇;常军亮;曹玉锋;
目的 原核表达甲型肝炎病毒（hepatitis A virus,HAV）衣壳蛋白VP1和VP3，并评价其免疫原性。方法 PCR法扩增VP1和VP3基因片段，克隆至载体pET-G28a中，构建重组表达质粒pET-G28a-VP1和pET-G28a-VP3，转化至感受态E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，12%SDS-PAGE分析表达产物。目的蛋白经离子交换层析纯化，复性后与多种佐剂配伍，免疫雄性BALB/c小鼠，随机分为VP1-MF59、VP1-AH、VP1-AP、VP1-AP-10CpG、VP1-AP-50CpG、VP3-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组，每组5只。ELISA法检测各组小鼠血清中IgG抗体效价，快速荧光灶免疫抑制试验测定VP1-AP、VP3-VP1-AP及PBS对照组小鼠血清中和抗体效价。结果 菌落PCR及测序结果证明，重组表达质粒pETG28a-VP1及pET-G28a-VP3构建正确。重组蛋白VP1和VP3相对分子质量分别约为37 000和26 000，主要以包涵体形式存在，表达量分别为18.6%和32.4%，纯度分别为86.3%和84.7%，且分别可与兔抗HAV抗血清及鼠抗HAVVP3抗血清发生特异性结合。VP1-AP-50CpG组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP组（q=22.05,P <0.01）,VP3-VP1-AP组小鼠血清的IgG抗体效价显著高于VP1-AP及VP3-AP组（q分别为22.05和22.49,P均<0.01）。与PBS对照组比较，VP1-AP及VP3-VP1-AP组小鼠血清的中和抗体效价显著升高（q分别为7.79和25.11,P <0.01）。结论 原核表达的HAV衣壳蛋白VP1和VP3纯度较高，且具有良好的免疫原性，制剂中添加CpG有利于增强抗原的免疫原性。本研究为HAV重组亚单位疫苗的研发奠定了基础。
2023年05期 v.36 524-530页 [查看摘要][在线阅读][下载 902K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 王金冬;马亚林;段招军;
目的 分析我国GⅡ. 4型诺如病毒（norovirus,NoV）GZ19株的进化特征，并明确其结合组织血型抗原（histoblood group antigens,HBGAs）受体的能力和方式。方法 根据GZ19株中的ORF2区序列，构建进化树，并分析其在HBGAs结合位点（HBGA binding sites,HBSs）和关键阻断表位的氨基酸序列。采用原核表达系统表达P颗粒并进行纯化，获得的蛋白经SDS-PAGE和间接ELISA法鉴定后，采用唾液结合试验和寡糖结合试验分析P颗粒的糖结合特征。结果GZ19株属于GⅡ. 4 Sydney[P31]谱系，其受体结合位点和阻断表位的氨基酸序列相对保守，与近5年其他GⅡ. 4Sydney[P31]毒株具有较高的同源性，而与GⅡ. 4 Sydney 2012原型株和GⅡ. 4 Sydney[P16]株的差异较大。P颗粒仅与A、B、O、AB分泌型唾液和H-di寡糖结合。结论 GZ19株代表目前GⅡ. 4 Sydney[P31]NoV的进化方向，P颗粒的成功表达及其与HBGAs受体的结合特征分析，为研究我国GⅡ. 4 NoVs的流行进化规律及疫苗开发奠定了基础。
2023年05期 v.36 531-536+544页 [查看摘要][在线阅读][下载 1029K] [下载次数：139 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴沛园;王晓蝶;刘鑫;武崇光;吉宁;王秀芳;吕占军;
目的 分析小鼠短散布核元件B1反义RNA(B1 antisense RNA,B1as RNA）静脉注射正常小鼠后，在小鼠血液及不同组织中的生物分布；以及转染培养的正常小鼠胚胎细胞后，细胞摄取B1as RNA的效率。方法 取6只8～12周龄BALB/c小鼠，雌雄各3只，经尾静脉注射20μg B1as RNA，分别于注射后不同时间经眼眶静脉丛采血；取54只8～12周龄BALB/c小鼠，经尾静脉注射20μg B1as RNA，注射后不同时间分别安乐处死6只小鼠，雌雄各3只，解剖后取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胸腺；将B1as RNA转染入培养的小鼠胚胎细胞，转染后不同时间取一定量的细胞，采用RT-q PCR法检测B1as RNA在小鼠血液及不同组织的生物分布以及胚胎培养细胞中B1as RNA的存留水平。将30只自然衰老的BALB/c小鼠（≥14月龄）分成3组：治疗组（经尾静脉注射20μg B1as RNA，每周1次）、无关RNA对照组（经尾静脉注射20μg Lac Z3F3R RNA，每周1次）和盐水对照组（注射相同体积的盐水），每组10只，另设年轻对照组（正常年轻的8～12周龄BALB/c小鼠，雌雄各5只），给药4周后，安乐处死各组小鼠，取肝脏组织，RT-q PCR法检测衰老相关基因（Sirt1、p21、p16~(INK4a)、p15~(INK4b)、p19~(Arf)）的表达水平。结果 尾静脉注射后，B1as RNA在小鼠血液中可存留约30 min，在大多数检测到的组织中可存留2～4 h，在肺中可存留约48 h;B1as RNA转染小鼠胚胎培养细胞后45 min，细胞摄取B1as RNA的效率约为每个细胞摄取400个B1as RNA分子。与盐水对照组比较，B1as RNA处理可显著下调p21、p16~(Ink4a)、p15~(Ink4b)、p19~(Arf)基因m RNA的表达（t分别为10.01、4.461、4.420和5.309,P均<0.05），显著上调Sirt1基因mRNA的表达（t=4.579,P<0.05）。结论 B1as RNA转染细胞可被细胞有效摄取。静脉注射小鼠后，B1as RNA可在血液和组织中停留一定时间，并调节衰老相关基因的表达，使其接近年轻正常小鼠的表达水平。
2023年05期 v.36 537-544页 [查看摘要][在线阅读][下载 976K] [下载次数：67 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 牛丽;韩瑞;贺龙;王瑛;郭慧娜;皇甫辉;
目的 研究C-C趋化因子配体5(C-C chemokine ligand 5,CCL5)在头颈鳞状细胞癌中的表达，并探讨CCL5对喉癌细胞生物学特性的影响。方法 基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库查找CCL5在头颈鳞状细胞癌中的表达情况。将喉癌细胞TU177转染siRNA(siRNA组)，并设对照（NC）组，CCK8法、细胞划痕试验、流式细胞术分别检测各组细胞增殖、迁移、细胞周期及细胞凋亡情况；RT-PCR、Western blot法检测CCL5敲降效率及多药耐药蛋白2(multidrug resistance protein 2,MRP2)、bcl-2相关x蛋白（bcl-2-associated x protein,Bax）mRNA转录及蛋白表达水平。结果 CCL5在头颈鳞状细胞癌的表达高于正常组织（P <0.05）。与NC组相比，siRNA组siRNA具有较高的敲降效率（t分别为12.898和22.656,P均<0.01）;siRNA敲降CCL5可抑制喉癌细胞增殖、迁移，促进喉癌细胞晚期凋亡及凋亡蛋白Bax的表达（t=2.600～11.667,P均<0.05）。结论 CCL5在头颈鳞状细胞癌中高表达，siRNA干扰CCL5通过上调Bax表达抑制喉癌细胞TU177增殖、迁移，促进凋亡，为CCL5可能作为治疗喉癌的新靶点奠定了基础。
2023年05期 v.36 545-550+558页 [查看摘要][在线阅读][下载 1024K] [下载次数：105 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 蒙小刚;宋扬;鲁会军;霍晓伟;吕香玉;刘锴;温树波;
目的 对猪外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes,PBMCs）干扰素诱导跨膜蛋白（IFN-induced transmembrane,IFITM）进行拓扑学分析，并检测PBMCs在体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）后IFITM基因mRNA转录水平的变化。方法 无菌采集PRRSV、猪圆环病毒2(porcine circovirus 2,PCV2)和乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）阴性的仔猪抗凝血，分离PBMCs,PCR扩增猪IFITM CDS序列，测序并进行拓扑学分析。PBMCs体外感染PRRSV，分别于感染后12、24、36和48 h收集细胞样品，RT-PCR法检测PBMCs中PRRSV感染情况，qRT-PCR法检测IFITM1、IFITM2和IFITM3基因mRNA转录水平的变化。结果 成功分离到猪PBMCs，并克隆获得了PBMCs源IFITM CDS全长序列，猪IFITM蛋白可能存在两种拓扑学结构。PBMCs接种PRRSV后24 h可产生明显的细胞病变。PRRSV可在PBMCs中复制。PRRSV感染早期可显著上调PBMCs中IFITM1、IFITM2和IFITM3基因mRNA的转录水平，且均在感染后第12 h达高峰，随后逐渐下降；IFITM1基因mRNA的转录水平在病毒感染后第36 h有所回升，然后又迅速回落。结论 PRRSV体外感染PBMCs可显著上调猪IFITM基因mRNA的转录水平，表明IFITM参与PBMCs抗病毒免疫反应。本研究为揭示机体抗PRRSV天然免疫反应提供了参考。
2023年05期 v.36 551-558页 [查看摘要][在线阅读][下载 1340K] [下载次数：91 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 闫甲丽;左群;祁芳冰;刘明杨;刘建伟;李素贞;柳森;王健;
目的 在人胚肾293F(human embryonic kidney 293F,HEK-293F)细胞中表达重组人白介素-29-Fc(recombinant human interleukin-29-Fc,rhIL-29-Fc)融合蛋白，并分析其体外抗肿瘤活性。方法 构建重组UCOE-IL-29-Fc表达质粒，瞬时转染HEK-293F细胞，经表达、纯化后获得rhIL-29-Fc融合蛋白，经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定；将rhIL-29和rhIL-29-Fc蛋白分别经左耳皮下免疫雌性日本大耳白兔，每组2只，0.5 mg/只，右耳静脉采血，分离血清，ELISA法检测半衰期；CCK-8试验检测rhIL-29-Fc蛋白对人结肠癌HT-29、人结肠癌HCT-116、人Burkkit淋巴瘤Daudi、人非小细胞肺癌NCI-H1975、人小细胞肺癌NCI-H209、人食管癌EC109和人胰腺癌PANC-1细胞的体外抗增殖效果，并计算半数抑制浓度（inhibitory concentration 50,IC_(50)）。结果 重组表达质粒UCOE-IL-29-Fc经双酶切及测序鉴定证明构建正确，瞬时转染HEK-293细胞6 d后，收获培养上清，经纯化获得的rhIL-29-Fc融合蛋白相对分子质量与预期相符，蛋白浓度为1.5 mg/mL，纯度为93%，可与小鼠抗人IL-29抗体特异性结合。rhIL-29-Fc蛋白半衰期为25 h，对7种肿瘤细胞显示出不同程度的增殖抑制效应，对不同细胞的IC_(50)也不同。结论 利用HEK-293F细胞成功表达rhIL-29-Fc融合蛋白，该融合蛋白半衰期比rhIL-29延长了20 h。根据7种肿瘤细胞显示出不同程度的体外增殖抑制效应和IC_(50)测定结果，发现rhIL-29-Fc融合蛋白的抗肿瘤活性高于rhIL-29。该研究为IL-29蛋白治疗肿瘤的开发奠定了基础。
2023年05期 v.36 559-565页 [查看摘要][在线阅读][下载 984K] [下载次数：357 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 尹永波;李学申;邱金霞;籍玉青;崔静;
目的 探讨解聚素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease 17,ADAM17)缺失对鼻咽癌细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生及线粒体功能的影响。方法 将3组ADAM17基因干扰质粒ADAM17 shRNA及空质粒ADAM17-shRNA-NC转染鼻咽癌细胞株（CNE1）,RT-PCR及Western blot法检测干扰效率，选择干扰效果最好的shRNA进行后续试验。CCK-8法检测各组细胞增殖能力；克隆形成试验检测细胞生长情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况和线粒体膜电位变化；荧光显微镜检测细胞线粒体氧化损伤产物ROS水平；丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）试剂盒检测细胞氧化应激标志物MDA和SOD含量；Western blot法检测细胞线粒体损伤标记物Bax/Bcl-2、cleaved-caspase 9/caspase 9、cleaved-caspase 3/caspase 3、c-Myc的表达。结果 ADAM17-shRNA2组干扰效果最好。与shRNA-NC组相比，ADAM17-shRNA2组细胞的增殖速率明显下降（t=8.964,P=0.036）；形成的集落数明显减小（t=10.351,P=0.014）；细胞凋亡数量明显增加（t=11.25,P=0.008）；细胞内代表ROS水平的荧光强度明显增强；线粒体膜电位明显下降（t=9.233,P=0.013）;SOD含量明显降低（t=7.233,P=0.034）,MDA含量明显升高（t=7.415,P=0.038）；细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-caspase 9/caspase 9、cleaved-caspase 3/caspase 3的水平均明显升高（t分别为8.985、9.021和7.789,P分别为0.023、0.011和0.031）,c-Myc蛋白表达水平明显减少（t=10.352,P=0.004）。结论 干扰ADAM17基因表达通过促氧化诱导SOD水平下降，MDA水平升高，进而缓解细胞膜的氧化损伤；同时促进细胞线粒体ROS表达水平，降低线粒体膜电位，体外抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。
2023年05期 v.36 566-573页 [查看摘要][在线阅读][下载 1045K] [下载次数：138 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杜文静;刘丹;丛鑫;庞立丽;毛彤瑶;段招军;
目的 体外培养GⅠ. 1型人札如病毒（human sapovirus,HuSaV），并制备其衣壳蛋白VP1多克隆抗体。方法 将中国疾病预防中心病毒病预防控制所腹泻室保存的GⅠ. 1型HuSaV阳性粪便标本接种至添加不同胆酸盐[甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、甘氨胆酸（GCA）]的人十二指肠腺癌细胞（HuTu-80）中，利用PCR和RT-qPCR法确定病毒感染、增殖及传代情况。PCR扩增VP1基因，克隆入原核表达载体pGEX-6P-1，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-VP1，转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组VP1蛋白纯化后免疫2只雌性新西兰大耳白兔，共免疫4次，免疫后18、28、38和48 d采血，ELISA法检测血清效价。结果 GⅠ. 1型HuSaV在胆酸盐GCA存在下可有效感染HuTu-80细胞，增殖后的病毒在HuTu-80细胞中能够稳定连续传3代。表达的重组GST-VP1蛋白相对分子质量约86 000，纯化后约60 000（切除GST标签）。制备的抗HuSaV VP1蛋白多克隆抗体效价可达1∶12 800以上。结论 利用HuTu-80细胞添加胆酸盐成功实现了HuSaV的体外分离培养，并制备了HuSaV VP1蛋白高效价多克隆抗体，为深入开展HuSaV的鉴定、感染及致病机制等奠定了基础。
2023年05期 v.36 574-579页 [查看摘要][在线阅读][下载 914K] [下载次数：102 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 何赛;刘志芳;李瑞玮;
目的 探讨长链非编码核糖核酸FRAPT(lncRNA FRAPT)在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）细胞中的表达，并分析其对TNBC细胞增殖、细胞周期及耐药的影响。方法 利用scRNASeqDB及TCGA在线生物信息学分析数据库，检测lncRNA FRAPT在TNBC中的表达情况及其与预后的相关性；利用Lipofectamine~(TM)2000向TNBC细胞MDA-MB-231中单独转染si-lncRNA FRAPT及si-Ctrl（阴性对照），磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)试验、流式细胞术检测转染后TNBC细胞的增殖及细胞周期变化，并检测对化疗药物紫杉醇（paclitaxel,PTX）的耐药情况。结果 TNBC组织和细胞中lncRNA FRAPT表达上调，且其高表达与TNBC患者较差的预后呈正相关（Hazard Ratio=1.66,P=0.047）。沉默lncRNA FRAPT显著抑制TNBC细胞的增殖，且细胞周期被阻滞在G1期；而沉默lncRNA FRAPT增加了TNBC细胞对PTX的敏感性。结论 lncRNA FRAPT在TNBC中高表达并与肿瘤预后相关，沉默lncRNA FRAPT可抑制TNBC细胞增殖、细胞周期，并增加了对化疗药物PTX的敏感性。
2023年05期 v.36 580-584页 [查看摘要][在线阅读][下载 949K] [下载次数：44 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]