- 高玲;吴陈彬;吴思佳;黄世豪;朱泓兴;尹良鸿;钱永常;
目的 筛选碱性木聚糖酶的高产菌株，并对其进行分子鉴定、酶学性质检测及培养条件优化。方法 采集山西、河南和浙江农田土壤样品，通过富集培养及分离后进行16S rDNA鉴定，筛选碱性木聚糖酶的高产菌株，并检测其酶学性质。单因素试验优化发酵条件，包括培养基碳源(木聚糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、麸皮、葡萄糖)、氮源[草酸铵、蛋白胨、酵母粉、(NH_4)_2SO_4、NH_4Cl、NaNO_3、尿素、牛肉膏、大豆粉、KNO_3、(NH_4)_2HPO_4或以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、(NH_4)_2HPO_4、大豆粉两两随机组合]、金属离子[CuCl_2、MgCl_2、ZnCl_2、Al_2(SO_4)_3、CoCl_2、MnCl_2、Ag NO_3、NaCl、CaCl_2、FeCl_2、BaCl_2、FeCl_3]、pH(3.0～10.0)及发酵温度(25、28、30、33、35、37、40℃)，响应面法优化培养基组分含量[木聚糖、(NH_4)_2HPO_4和大豆粉]。采用优化的培养条件培养碱性木聚糖高产菌株，检测木聚糖酶酶活，并与模型预测结果进行对比。结果筛选出1株碱性木聚糖酶高产菌株，命名为SX6-18，经16S rDNA鉴定为类芽孢杆菌(Paemibacillus)。SX6-18菌株产生的碱性木聚糖酶在温度为25～55℃和pH 6.0～10.0的范围内可保持70%以上的相对活性；Mg~(2+)可促进碱性木聚糖酶活，Fe~(3+)、Mn~(2+)和Cu~(2+)抑制酶活。确定最适碳源为木聚糖，氮源为大豆粉和(NH_4)_2HPO_4组合，金属离子为Fe~(3+),pH为8.0，发酵温度为30℃。确定最适培养基组分含量为：15.00 g/L木聚糖、3.03 g/L(NH_4)_2HPO_4、3.28 g/L大豆粉。采用优化的培养基及发酵条件下生产的碱性木聚糖酶酶活达701.08 U/mL，与预测值(693.96 U/mL)相近。结论 成功筛选出了1株碱性木聚糖酶高产菌株SX6-18，在碱性条件下可保持较高酶活，本实验为木聚糖酶在造纸及洗涤等领域的应用奠定了基础。
2023年03期 v.36 321-329页 [查看摘要][在线阅读][下载 1081K] [下载次数：749 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 庄晓梅;郭瑶;赵志壮;
目的 建立一种急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3,FLT3)-激酶结构域突变(tyrosine kinase domain,TKD)的高灵敏度检测方法，并将该方法应用于AML微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)的监测。方法 构建FLT3野生型质粒和FLT3-D835Y突变型质粒，按一定比例混合后制备FLT3-D835Y突变率为50%、1%、0.1%和0%的质粒标准品，以其为检测对象，联合限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)识别法和一代测序法建立新的FLT3-TKD检测方法。用建立的方法检测含不同FLT3-D835Y突变率的质粒DNA标准品和血液样本DNA标准品，以验证方法的灵敏度；用建立的方法检测AML患者治疗前后的基因组DNA样本，以监测MRD。结果 构建的FLT3野生型质粒和FLT3-D835Y突变型质粒经测序证明构建正确。在纯化的质粒DNA和收集的血液样本DNA中，建立的方法通过一代测序结合EcoRⅤ/XhoⅠ双酶切和回收突变片段的步骤，将灵敏度提高至0.1%；用该方法在1名AML患者完全缓解期外周血样本中检测到MRD，而直接一代测序法未检测到MRD。结论 本研究开发了一种高灵敏度检测FLT3-TKD突变的方法，该方法对指导AML治疗以及监测其完全缓解期内MRD具有重要临床意义。
2023年03期 v.36 330-335页 [查看摘要][在线阅读][下载 1017K] [下载次数：121 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 毕江坤;俞露;张宇;张五妮;李利;刘涵;
目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化，以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计，通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化，找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果，其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为：上样量15 mg/mL，流速120 cm/h，洗脱液pH 7.0～8.0，洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg，在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件，为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。
2023年03期 v.36 336-340页 [查看摘要][在线阅读][下载 884K] [下载次数：440 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张树杰;王梦涵;朱晓文;周宏达;刘洪涛;孙跃秋;夏立新;张夫坤;
目的 建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)的双抗体夹心ELISA检测方法，并进行验证。方法 以VZV全病毒抗原为免疫原，通过小鼠杂交瘤融合技术筛选可稳定分泌抗VZV-g E抗体的杂交瘤细胞株，间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价，经Hi Trap~(TM)Mabselect~(TM)Su Re和Hi Trap~(TM)Desalting纯化后，12%SDS-PAGE分析单克隆抗体纯度，Western blot法检测特异性，小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定亚型。经表位叠加试验筛选捕获抗体及酶标抗体，棋盘滴定法确定捕获抗体(0.25、0.5、1、2、5和10μg/m L)和酶标抗体(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000和1∶10 000稀释)工作浓度后，建立VZV-g E含量的双抗体夹心ELISA检测方法。验证方法的线性范围、准确性、精密性和特异性。采用建立的方法检测3批7 L生物反应器培养1～14 d的CHO-VZV-g E细胞培养上清中g E含量。结果共获得4株稳定分泌抗VZV-gE特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株，命名为mAb-B2、mAb-11、K9C7和K9F4，小鼠腹水抗体效价为10~6～10~7，纯化后纯度约为97%，均可与VZV全病毒蛋白发生特异性结合，轻链均为κ链，重链分别为IgG_(2b)、IgG_1、IgG_(2b)及Ig G_(2a)。确定mAb-B2作为捕获抗体，HPR标记的mAb-11作为酶标抗体，两者最佳工作浓度分别为1.5μg/mL和1∶5 000稀释。g E抗原内部参考品浓度在1.95～1 000 ng/mL范围内，与A_(450)呈良好的线性关系，四参数方程为：Y=(0.15-3.99)/[1+(X/67.4)~(1.49)]+3.99,R~2为0.999；准确性验证回收率为94.9%～114.0%；精密性验证变异系数(CV)均<15%；除CHO-VZV-gE细胞培养上清、水痘减毒活疫苗和带状疱疹减毒活疫苗外，其他检测样品的A_(450)均<0.15，无交叉反应。3批CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量随培养时间的延长逐渐升高，且在14 d内与培养时间呈正相关(R~2=0.995 6,P=0.000 1)。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的准确性、精密性和特异性，可用于VZV疫苗中g E抗原含量的快速检测。
2023年03期 v.36 341-346页 [查看摘要][在线阅读][下载 879K] [下载次数：626 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 樊雪;汪海峰;王一平;廖辉;周隽逸;周荔葆;
目的 建立冻干人用狂犬病疫苗原液纯度的体积分子排阻高效液相色谱(size exclusion column-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法，并进行验证。方法 采用TSK-gel G6000PWXL色谱柱(7.8 mm×30 cm,13μm)进行测定，流动相为：0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.8)；流速为：0.5 mL/min；检测波长为：280 nm；进样量为：20μL；柱温为：30℃。验证方法的系统适用性、专属性、精密性、耐用性，并确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液及1批冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)原液的纯度。结果 参比品与两种基质制备的冻干人用狂犬病疫苗原液目的蛋白色谱峰的分离度均> 1.5，峰拖尾因子均<1.5；空白溶剂在目的蛋白出峰位置无吸收峰，不干扰测定；精密性验证中的保留时间和峰面积RSD均<2.0%；定量限为10μg/mL，检测限为4μg/mL；参比品在278、280、282 nm 3种不同检测波长下连续进样3次，保留时间和峰面积RSD均<2.0%。4批冻干人用狂犬病疫苗原液的纯度均> 97%。结论 建立的冻干人用狂犬病疫苗原液纯度SECHPLC检测方法具有良好的专属性、精密性及耐用性，为人用狂犬病疫苗的质量控制提供了可靠方法。
2023年03期 v.36 347-351页 [查看摘要][在线阅读][下载 841K] [下载次数：287 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 张姮婕;唐瑶;蒋佳兴;马晶;李炎;王叔桥;杨蕾;
目的 建立基于连续流动注射安培法的多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的检测方法，并进行验证。方法 超滤法去除样品中的大分子物质后，采用3700全自动化学分析仪检测氰化物残留量，进样时间为：35 s；进样体积为：200μL；泵速为：40%；样品周期时间为：140 s；紫外波长为：312 nm；安培检测器。验证方法的专属性、基质效应、线性范围、检出限、定量限、准确性、精密性及稳定性。采用建立的方法检测5个厂家生产的b型流感嗜血杆菌结合疫苗及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物原液(13批)、结合物原液(21批)中氰化物残留量。结果 空白样品对检测无干扰；b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗多糖衍生物和结合物原液基质效应溶液的回收率分别为97.4%、102.4%、96.8%、99.8%,CV均<15%；氰基浓度在0.312 5～80 ng/mL范围内，与峰高呈良好的线性关系，回归方程为：y=133.13 x+57.556,R~2=0.999 1；检出限为0.2 ng/mL，定量限为0.6 ng/mL；加入氰基浓度为5、10、20 ng/mL对照溶液样品的回收率均值分别为108.9%、106.5%、103.5%,RSD为6.4%；精密性验证的CV均<15%；氰基浓度为80、40、20、5 ng/mL的对照溶液连续进样20针的平均浓度分别为76、38、18、5 ng/mL,CV均<15%。13批多糖衍生物原液样品均有检出氰化物残留，21批结合物原液样品中2批未检出，其他均有检出。结论 本研究建立的方法具有良好的准确性、精密性及稳定性，可应用于多糖蛋白结合疫苗中氰化物残留量的定量检测。
2023年03期 v.36 352-356+362页 [查看摘要][在线阅读][下载 863K] [下载次数：140 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]