- 胡小华;王海伟;李洁涵;胡月凤;朱卫华;杜琳;
目的 评价15价肺炎球菌结合疫苗（15-valent pneumococcal conjugate vaccine,PCV15）的动物急性、长期毒性及免疫原性。方法 将60只ICR小鼠随机分为磷酸铝佐剂对照组、0.9%NaCl对照组和2人份剂量PCV15组，每组20只，雌雄各半，进行急性毒性试验；将90只SD大鼠随机分为磷酸铝佐剂对照组、0.9%NaCl对照组和1人份剂量PCV15组，每组30只，雌雄各半，共免疫5次，间隔28 d，进行长期毒性试验；将45只NIH小鼠随机分为0.9%NaCl组、1/4人用剂量的市售13价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）组和1/4人用剂量的PCV15组，每组15只，雌性，共免疫3次，间隔2周，进行免疫原性试验及免疫过程中安全性观察，全程监测并记录小鼠的体质量、体征及行为变化，并在每次免疫2周后经眼眶采血，间接ELISA检测血清中抗各型肺炎链球菌荚膜多糖抗体水平。结果 急性毒性试验表明，注射2人份剂量PCV15后，小鼠均未出现明显异常反应或死亡。长期毒性试验显示，1人份剂量的PCV15对大鼠临床症状、血液学和血清生化指标无明显影响，各器官未见明显病理学异常。免疫原性试验及免疫过程中安全性观察显示，PCV15组小鼠的平均体质量增加与0.9%NaCl对照组比较，差异无统计学意义（t=0.62～1.02,P=0.32～0.54）;PCV15组免疫3次后，小鼠抗各型荚膜多糖抗体几何平均滴度（geometric mean titer,GMT）均显著上升（2次与1次比较：t=9.69,P=6.88 E-08,3次与2次比较：t=7.56,P=1.32 E-06），且对于PCV15组与PCV13组共有的13个血清型，诱导的抗体水平PCV15组明显高于PCV13组（1、2、3次t分别为4.51、4.51和4.28,P分别为0.000 7、0.000 8和0.001 1）。结论 PCV15具有良好的安全性和免疫原性，为该疫苗的进一步研究提供了参考。
2022年12期 v.35 1414-1421页 [查看摘要][在线阅读][下载 1112K] [下载次数：289 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 蔡路奎;梁疆莉;李婧妍;李婉西;刘双芹;吴易梅;周建平;周健;
目的 评价模拟振动后组分无细胞百白破联合疫苗（diphtheria,tetanus,and acellular component pertussis combined vaccine,DTacP）的稳定性。方法 选取3批中国医学科学院医学生物学研究所自主研制的DTacP，根据国家标准GB/T 4857.23-2012规定的方法进行随机振动试验。对振动前后的3批样品进行上清中抗原含量测定、Zeta电位测定、电镜观察、效价测定、鉴别试验、物理检查（外观、装量、渗透压摩尔浓度）、化学检定（pH、铝含量、游离甲醛含量）、无菌检查、特异性毒性检查及毒性逆转试验，评价疫苗的稳定性。结果 振动前后，3批DTacP上清中百日咳毒素（pertussis toxin,PT）、丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）及黏附素（pertactin,PRN）抗原含量均值差异均无统计学意义（t=0.16～1.73,P均> 0.05），白喉类毒素（diphtheria toxoid,DT）及破伤风类毒素（tetanus toxoid,TT）均未检测到絮状反应；Zeta电位均值差异无统计学意义（t=0.40,P> 0.05）；电镜观察未见明显的结构变化；百日咳、白喉、破伤风疫苗效价均值差异均无统计学意义（t=0.37～0.97,P均> 0.05）；外观、装量、鉴别试验、无菌检查、特异性毒性检查、毒性逆转试验均未见明显变化；pH、氢氧化铝含量、游离甲醛含量、渗透压均值差异均无统计学意义（t=0.48～1.06,P均> 0.05）。结论 DTacP在模拟振动条件下稳定性良好。
2022年12期 v.35 1422-1426页 [查看摘要][在线阅读][下载 921K] [下载次数：127 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王娜;刘琼;杨雨欣;李慧;张炜;马国荣;陈耀庚;万巧凤;
目的 初步评价结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M. tb）Ag85B DNA疫苗的免疫效果。方法 对含HSV2-gD信号肽基因和Rv1886c基因（共963 bp核苷酸序列）的重组质粒pcD-sRv1886c进行双酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pcD-s Rv1886c转染CHO细胞，Western blot法检测CHO细胞培养液中Ag85B蛋白的表达情况。将重组质粒pcD-sRv1886c经肌肉注射免疫C57BL/6J小鼠，共免疫2次，间隔14 d，首次免疫后14、28及42 d经小鼠眼眶后静脉丛采血，分离血清，间接ELISA法检测小鼠血清中IgG及IgG1抗体效价；首次免疫后42 d无菌取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，流式细胞术检测分泌IFNγ~+的CD4~+T及CD8~+T细胞比例，CCK8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果 双酶切和测序鉴定证明重组质粒pcD-sRv1886c构建正确，转染CHO细胞后表达的蛋白可与鼠抗Ag85B单克隆抗体发生特异性结合。首次免疫后14 d，重组质粒免疫组小鼠血清中IgG及IgG1特异性抗体效价分别为1∶1 720和1∶460,28 d后为1∶5 760和1∶2 560,42 d后为1∶6 080和1∶2 720。首次免疫后42 d，重组质粒免疫组和PBS阴性对照组小鼠脾细胞中CD3~+CD4~+IFNγ~+细胞比例分别为（2.03±0.23）%和（0.14±0.02）%,CD3~+CD8~+IFNγ~+细胞比例分别为（1.05±0.08）%和（0.13±0.01）%，差异均有统计学意义（t分别为18.38和11.58,P均<0.001）。重组质粒免疫组小鼠脾淋巴细胞SI为5.02，明显高于PBS对照组（1.06），且差异有统计学意义（t=15.66,P <0.001）。结论 M. tb Ag85B DNA疫苗可有效诱导机体产生体液免疫及细胞免疫效应。
2022年12期 v.35 1427-1431页 [查看摘要][在线阅读][下载 1055K] [下载次数：216 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 李彬;石刚;杜宗利;辛晓芳;叶强;徐颖华;
目的 对1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体（简称钩体）病流行菌株与其同血清群疫苗株进行比较基因组学分析。方法 应用高通量测序技术对黄疸出血群钩体流行株200502（简称流行株200502）进行全基因组序列测定，并与其同血清群疫苗株56601进行比较基因组学分析；选取GenBank中已公布的包括疫苗株56601在内的9株不同基因种的代表性钩体菌株构建系统发育进化树。结果 流行株200502全基因组序列全长为4 543 190 bp，含有编码基因3 580个，其中具有直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）功能2 192个。流行株200502与疫苗株56601基因组平均核苷酸一致性为99.2%，存在共有基因3 245个，流行株200502含有特有基因242个。以疫苗株56601为参考，在流行株200502中共鉴定出2 005个插入缺失（indel）和19 799个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点，其中编码区有8 485个同义SNP位点、3 484个非同义SNP位点，涉及菌株的细胞运动、信号转导机制、防御机制等相关基因。流行株200502与L. interrogans、L. noguchii和L. kirschneri 3个基因种进化亲缘性较近。结论 获得了我国当前黄疸出血群流行株200502基因组的基本特征，确定了其与血清型疫苗株56601的差异，为钩体疫苗的改进提供了实验依据。
2022年12期 v.35 1432-1436页 [查看摘要][在线阅读][下载 970K] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 裴捷;杨祥;汪梦俊;刘睿伦;周金戈;吕诗韵;王文辉;郭靖;孟胜利;申硕;
目的 以Vero细胞及人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RD）细胞嗜性差异的柯萨奇病毒A10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）2个毒株为模板，分别构建感染性克隆，并完成病毒拯救，为CV-A10毒株的细胞嗜性研究奠定基础。方法 分别扩增Vero~+/RD~+及Vero~-/RD~+细胞嗜性差异的CV-A10毒株基因组，在5′端引入T7启动子序列，3′端引入polyA尾及NotⅠ酶切位点。将扩增得到的基因组序列与线性化pBR322载体以无缝连接技术连接得到全长质粒，经线性化后分别与T7-RNA聚合酶表达质粒共转染RD细胞完成病毒拯救。通过病毒感染后细胞形态观察及间接免疫荧光试验，比较拯救毒株对Vero细胞嗜性的差异。结果 成功构建了Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株2种感染性克隆，并在RD细胞内完成病毒拯救，序列测定结果表明拯救毒株与亲本毒株序列一致。拯救毒株rCV-A10-010195能够有效感染Vero细胞并形成典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE），而rCV-A10-3482无法有效感染Vero细胞。结论 建立了2株Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株反向遗传操作系统，为CV-A10毒株细胞嗜性的研究奠定了基础。
2022年12期 v.35 1437-1442页 [查看摘要][在线阅读][下载 1066K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 董慧玲;刘祥辰;孔鹏洲;徐恩伟;宋彬;
目的 建立食管鳞癌（esophageal squamous cancer,ESCC）奥沙利铂（oxaliplatin,L-OHP）耐药细胞株，全转录本测序筛选与L-OHP耐药相关的基因，探索L-OHP耐药机制。方法 采用L-OHP大剂量冲击与逐步递增药物浓度的方法建立人ESCC L-OHP耐药细胞株KYSE150/L-OHP，采用CCK-8法鉴定耐药细胞株的耐药性；光学显微镜下观察耐药细胞的形态学改变；Transwell小室试验检测耐药细胞侵袭/迁移能力的变化；全转录本测序筛选KYSE150和KYSE150/L-OHP细胞差异表达基因，并对差异表达基因进行KEGG通路富集和RT-PCR验证。结果 L-OHP耐药细胞模型KYSE150/L-OHP的耐药指数为（4.0±1.35），明显高于亲本细胞（t=22.9,P <0.01）；光镜下KYSE150/L-OHP细胞体积增大，形态不规则；与亲本细胞株相比，KYSE150/L-OHP细胞的侵袭和迁移能力均显著增强（t分别为25.49和46.05,P均<0.000 1）；全转录本测序结果显示，P13K-Akt、MAPK、Hippo信号通路可能介导L-OHP耐药的发生过程；RT-PCR验证差异基因表达与测序结果一致。结论 成功建立了人ESCC L-OHP耐药细胞模型KYSE150/L-OHP，全转录本测序技术探讨了L-OHP化疗耐药的分子机制，为临床晚期ESCC L-OHP耐药患者的治疗提供了思路。
2022年12期 v.35 1443-1448+1457页 [查看摘要][在线阅读][下载 1185K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 胡小敏;王燕;程旭敏;罗寰;
目的 探讨miR-153-5p对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移和侵袭的影响。方法 RT-qPCR法检测胃癌和癌旁组织（河北北方学院附属第一医院2016年1月—2018年12月经病理确诊的胃癌患者手术切除样本）以及正常胃细胞GES-1和胃癌细胞系（GES-1、MHCC97H、MKN-1、SGC-7901、MKN45、MGC803）中miR-153-5p的表达；将SGC-7901细胞分别或联合转染各质粒后分为miR-NC、miR-153-5p mimic、miR-153-5p inhibitor、pc-NC、pc-MMP-16、miR-153-5p mimic+pc-NC和miR-153-5p mimic+pc-MMP-16组，以未处理的SGC-7901细胞为对照组。克隆形成试验检测细胞增殖能力，Transwell试验检测细胞侵袭能力，划痕试验检测细胞迁移能力，Western blot法检测基质金属蛋白酶-16(matrix metalloproteinase-16,MMP-16)表达水平，Targetscan网站和双荧光素酶报告试验分别预测和验证miR-153-5p与MMP-16的靶向关系。结果 在胃癌中，miR-153-5p的表达与性别、年龄和吸烟史无关（χ~2分别为0.001、1.100 2、0.096,P均> 0.05），而与肿瘤大小、肿瘤-淋巴结-远处转移（tumor-node-metastasis,TNM）分期、淋巴结转移及分化成度有关（χ~2分别为4.444、5.094、8.487、9.427,P均<0.05）;miR-153-5p在胃癌组织和细胞中低表达。与对照组相比，miR-153-5p mimic组细胞克隆形成率、划痕闭合率及侵袭细胞数均显著降低（t分别为7.744、4.199、6.423,P均<0.05）;miR-153-5p与MMP-16具有靶向关系，在3′UTR区存在结合位点；与miR-NC组相比，miR-153-5p mimic组MMP-16蛋白表达水平显著下调（t=11.532,P <0.01），与pc-NC组相比，pc-MMP-16组MMP-16蛋白表达水平显著上调（t=10.694,P <0.01）；与miR-153-5p mimic+pc-NC组相比，miR-153-5p mimic+pc-MMP-16组细胞MMP-16蛋白表达水平、细胞克隆形成率、细胞侵袭数、划痕闭合率均显著升高（t分别为13.802、7.762、9.752、5.091,P均<0.01）。结论 miR-153-5p通过靶向MMP-16抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。
2022年12期 v.35 1449-1457页 [查看摘要][在线阅读][下载 1252K] [下载次数：67 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 魏多前;单璞;张转;郝少杰;王志标;李树香;徐静;
目的 以人急性白血病单核细胞THP-1为模型，建立一种体外评价佐剂诱导人源化细胞炎症因子水平的方法。方法 以细菌内毒素标准品为阳性对照，与佛波酯（phorbol myristate acetate,PMA）共刺激THP-1细胞，检测炎症因子IL-8、干扰素诱导蛋白-10(interferon-induced protein,IP-10)、IL-1β及单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein,MCP-1）的分泌水平，分别对PMA终浓度（25、5、1、0.1 ng/mL）、刺激时间（4、16、24 h）和细胞密度（1×10~5、5×10~5、1×10~6个/mL）进行优化，确定最佳条件。用不同佐剂[（Toll样受体（toll-like receptors,TLR）激动剂类佐剂Pam2CSK4和TLR4以及乳剂类佐剂MF59和AS03]与PMA刺激THP-1细胞，考察不同佐剂刺激产生炎症因子的水平。结果 炎症因子IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1的最佳诱导条件分别为：PMA终浓度0.1、1、5、1 ng/mL，培养时间16、16、4、24 h，细胞密度均为1×10~6个/mL。不同佐剂诱导产生的炎症因子水平不同，其中Pam2CSK4和LPS-B5大于0.001μg/mL即可诱导产生较高水平的炎症因子，而MF59和AS03诱导产生的炎症因子水平较低。结论 成功建立了一种体外检测方法，可用于评价佐剂诱导产生的炎症因子IL-8、IP-10、IL-1β、MCP-1水平，为佐剂反应原性的研究提供了参考。
2022年12期 v.35 1482-1487+1494页 [查看摘要][在线阅读][下载 1058K] [下载次数：318 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 马玲玲;马红梅;吴霜;王东;李勇;马臣杰;曾瑾;
目的 原核表达产气荚膜梭菌毒素β1(Clostridium perfringens Beta1 toxin,CPB1)，建立该毒素抗体的间接ELISA检测方法。方法 利用基因工程技术获得cpb1基因，克隆至载体pET32a，构建重组质粒pET32α-cpb1，转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CPB1。以重组蛋白CPB1作为包被抗原，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立CPB1抗体的间接ELISA检测法。并以CPB1的单克隆抗体McAb 1K19为一抗，优化包被蛋白的包被浓度、一抗稀释度、封闭时间及二抗稀释度，确定方法的临界值，验证方法的特异性、精密性、灵敏性。采用建立的方法检测201份正常牛血清样品及阴性、阳性小鼠血清样品。结果 表达的重组蛋白CPB1相对分子质量约为54 000(CPB1蛋白与硫氧化还原蛋白的融合蛋白)，主要以包涵体形式表达。包被蛋白最佳浓度为10μg/mL，一抗最佳稀释度为1∶16384，最佳封闭时间为120 min，二抗最佳稀释度为1∶1 000。除B和C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C. p.）外，其他常见食源性致病菌A_(450)均低于0.3；批内及批间精密性CV均<10%；当McAb 1K19稀释度为1∶32 768，即浓度为0.002μg/μL时，A_(450)为0.223 5,P/N为10.2。201份正常牛血清及阴性小鼠血清均为阴性，阳性小鼠血清为阳性，检测符合率为100%。结论 制备的重组蛋白CPB1可用于建立CPB1抗体的间接ELISA检测法，建立的方法具有良好的精密性及较高的灵敏性，可用于大量临床样品的检测。
2022年12期 v.35 1488-1494页 [查看摘要][在线阅读][下载 1045K] [下载次数：251 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 毕华;朱香;卢宁;牛林茹;杨凌;张晓峰;周勇;梁雅丽;
目的 建立黏质沙雷菌（Serratia marcescens）Benzonase~?核酸内切酶（Serratia marcescens Benzonase~? endonuclease,SMBE）通用型定量检测方法，并进行验证。方法 以突变体SMBE（第110位组氨酸突变为丙氨酸）基因BEHA为模板，PCR法扩增BEHA基因，插入至载体pET-20b（+）中，构建重组表达质粒pET-20b（+）-BEHA，经菌落PCR和测序鉴定。重组表达质粒转化E. coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达后进行一步Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化，纯化产物经15%SDS-PAGE和分光光度计分析，并检测酶活性。用纯化BEHA免疫家兔，以获得的多克隆抗体作为包被抗体，标记HRP的多克隆抗体作为检测抗体，建立SMBE的双抗体夹心ELISA检测法。验证方法的线性范围、准确度、精密性，并确定定量限。采用建立的方法及市售试剂盒分别检测3个厂家生产的SMBE。结果 菌落PCR和测序鉴定证明，重组表达质粒pET-20b（+）-BEHA构建正确，第110位氨基酸成功突变为丙氨酸。BEHA的纯度> 95%，表达量为3 mg/100 mL，酶活性大幅降低。SMBE标准品在0～20 ng/mL范围内与A_(450)呈良好的线性关系；16、10、0.6 ng/mL的SMBE标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06%、-5.40%、3.33%;12和2 ng/mL的SMBE标准品重复10次检测结果 CV分别为2.48%和2.91%；定量限为0.2 ng/mL。与市售试剂盒比较，本研究建立的方法对3个厂家生产的SMBE检测结果更接近理论值。结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有较好的准确度和精密性，该方法可定量检测多种市售SMBE产品，是一种SMBE的通用型定量检测方法。
2022年12期 v.35 1495-1499+1505页 [查看摘要][在线阅读][下载 1175K] [下载次数：92 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杜天飞;容新宗;杨盛理;张勇侠;武志强;李春阳;刘兰军;
目的 建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白（anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG）淋巴细胞毒效价定量检测方法，并进行验证。方法 采用人Jurkat细胞作为靶细胞，抗人T细胞兔免疫球蛋白（商品名：Grafalon）作为待检样品，建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系，考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响，并对方法的精密度进行验证。结果 优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体（1∶5稀释）+50μL细胞（5×10~6个/mL）；细胞传代密度为2×10~5个/mL传代培养72 h或3×10~5个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳；当细胞生长状态较好且一致时，从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价，变异系数（CV）为6.32%，重复性良好；不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次，CV为4.15%，中间精密度良好。结论 建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法，为ALG效价测定提供了一种客观、准确的评价手段。
2022年12期 v.35 1500-1505页 [查看摘要][在线阅读][下载 1005K] [下载次数：99 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]