- 汪梦俊;安欢欢;田宇璇;刘睿伦;张小宇;吴杰;郭靖;申硕;
目的 制备SARS-CoV-2非结构蛋白1(non-structure protein 1,NSP1)兔抗血清，并用其检测SARS-CoV-2NSP1在灭活疫苗生产过程中的含量变化，为建立灭活疫苗纯度、工艺质量监控方法奠定基础。方法 选择带DE3的E. coli原核表达系统表达SARS-CoV-2 NSP1全长蛋白，纯化后免疫日本大耳白兔，共免疫6次，每次间隔14 d，采集全血，获得NSP1兔抗血清；以纯化的NSP1蛋白为抗原，Western blot法鉴定兔抗血清纯度，同时利用RD细胞表达NSP1-eGFP融合蛋白，裂解后作为抗原对NSP1兔抗血清进行特异性鉴定；以SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中1～4 d细胞裂解液及纯化后病毒颗粒为抗原，NSP1兔抗血清及M、S、E、N兔抗血清为一抗，Western blot法鉴定样品中抗原蛋白的含量变化。结果 成功表达带有GST标签的NSP1蛋白，并获得相应的兔抗血清，且抗原纯度较高；制备的兔抗血清能正确识别真核表达的NSP1-eGFP融合蛋白，并能鉴定灭活疫苗生产过程中蛋白含量的变化；灭活疫苗成品中不含NSP，疫苗纯度高；E蛋白与其他3种主要结构蛋白M、S、N的表达时相不同，早期表达晚期下降。结论 制备的NSP1兔抗血清可用于NSP1和E蛋白功能的研究，以及灭活疫苗生产过程中纯度和质量的监控。
2022年09期 v.35 1034-1039+1044页 [查看摘要][在线阅读][下载 930K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 徐康维;郭航炜;李星星;谢莹;权娅茹;赵慧;李长贵;
目的 将AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株免疫小鼠，检测小鼠IgG和IgA抗体产生情况，并对免疫后小鼠进行PR8流感病毒攻击，评价其保护效果。方法 用AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株滴鼻免疫小鼠2次，免疫间隔21 d，分别于第1次免疫后0、7、14、21、28、35和42 d采集小鼠血清和肺泡灌洗液，间接ELISA法检测IgG和IgA抗体效价。对采用1次免疫或0、14 d 2次免疫程序的小鼠进行5倍半数致死剂量的PR8流感病毒攻击，观察攻击后小鼠死亡情况及体重变化，攻击后第3天取小鼠肺脏，检测病毒载量。结果 小鼠第1次免疫后7、14和21 d，血清IgG抗体GMT分别为152、230和264，肺泡灌洗液IgA抗体GMT分别为23、211和92；第2次免疫后7、14和21 d，血清IgG抗体GMT分别为348、919和1 056，肺泡灌洗液IgA抗体GMT分别为53、368和160。免疫1次后14 d进行攻击，小鼠保护率为83.33%(5/6)，体重降低幅度减少，肺脏病毒载量显著降低；0、14 d免疫2次后14 d进行攻击，小鼠保护率为100%(6/6)，体重基本不降低，肺脏未检测到病毒。结论 AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株在小鼠中具有良好的免疫原性，显著降低小鼠AA-PR8流感病毒攻击后的肺脏病毒载量，提高了生存率。
2022年09期 v.35 1040-1044页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K] [下载次数：184 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈磊;孟庆敏;张改梅;孙光卫;耿丽娜;金加洪;赵丽丽;谢学超;徐颖之;顾美荣;卞莲莲;刘建凯;
目的 对柯萨奇病毒A组6型（coxsackievirus A6,CA6）中和抗体检测用毒株进行病毒滴度标定，并评价该毒株的专属性和适用性。方法 由3名实验员（A、B、C）在3 d内对CA6候选检测毒株分别进行3次独立的病毒滴度测定，标定该毒株的病毒滴度。采用CA6候选检测毒株测定CA6、肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）、柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16,CA16）、柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10,CA10）小鼠免疫血清的中和效价，同时检测12份CA6小鼠免疫血清和12份CA6自然感染人血清的中和效价。结果 A、B、C实验员测定CA6候选检测毒株病毒滴度均值分别为（7.861±0.075）、（7.819±0.110）、（7.875±0.140）LgCCID_(50)/mL，检测结果差异无统计学意义（P> 0.05），最终标定病毒滴度为7.852 LgCCID_(50)/mL。该毒株仅可与CA6小鼠免疫血清发生中和反应，与EV71、CA16、CA10免疫血清无交叉反应。每份小鼠免疫血清和自然感染人血清中和抗体效价的最大值与最小值比值（MAX/MIN）均<4,CV在1.65%～12.44%之间。结论 CA6候选检测毒株具有良好的专属性和适用性，可用于CA6中和抗体的检测。
2022年09期 v.35 1045-1049页 [查看摘要][在线阅读][下载 898K] [下载次数：243 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 沈钱通;李思奇;安彤;杨宏宏;张柯欣;陈刚;庄昉成;高孟;
目的 原核表达柯萨奇病毒A组6型（coxsackievirus A6,CVA6）VP1蛋白与白喉毒素无毒突变体CRM197片段A的融合蛋白（CRM197A-CVA6 VP1），并评价其免疫原性。方法 将经密码子优化的CRM197A基因与CVA6 VP1基因连接，克隆至原核表达载体pET-28a中，构建重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1，转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白，经Ni-NTA柱层析及透析复性后获得重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1，检测重组蛋白的粒径及电位，并进行蛋白荧光光谱检测。经沙鼠腹腔注射免疫铝佐剂吸附的重组蛋白CRM197A-CVA6VP1,20μg/（只·0.5 mL），同时设对照组（等体积的铝佐剂）；1周后进行加强免疫，免疫途径及剂量同上。首次免疫后4周，经沙鼠眼眶采血，分离血清，ELISA法检测血清结合抗体，微量细胞病变法检测血清中和效价。相同方法对沙鼠进行分组及给药，于初次免疫4周后，经沙鼠腹腔接种CVA6病毒液，1×104TCID50/只，观察沙鼠的存活情况。结果 测序结果表明，重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1构建正确。重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1的粒径为81.16 nm，电位为23.12 mV,280 nm激发光下检测到最大发射波长为353 nm，纯度达88.3%。试验组及对照组沙鼠血清中结合抗体效价的几何平均数分别为44 565和0，中和抗体效价的几何平均数分别为30.4和0，两组间结合抗体效价和中和抗体效价的几何平均数差异均有统计学意义（P均<0.05）。对照组沙鼠于攻毒后第3天开始出现死亡，第13天全部死亡；试验组沙鼠在攻毒过程中未发现死亡，保护率达100%。结论 原核表达的重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1在沙鼠体内可产生良好的免疫原性。
2022年09期 v.35 1050-1054页 [查看摘要][在线阅读][下载 928K] [下载次数：181 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 李乐凯;吴业红;徐军;迟祥;李爽;席莉;张雪梅;郭占龙;
目的 优化生物反应器高密度无血清培养全悬浮MDCK细胞和流感病毒的条件，并放大培养规模，建立MDCK细胞和4种型别流感病毒的培养工艺。方法 分别在不同溶氧（DO）、pH、转速、接种密度条件下培养MDCK细胞，每24 h取样计数，优化细胞培养条件后，放大至50 L生物反应器，并接种4种型别流感病毒（H1N1:A/California/7/2009、H3N2:A/Texas/20/2012、BV:B/Brisbane/60/2008、BY:B/Phuket/3073/2013），接毒条件为MOI=10-4，胰酶终浓度为15μg/mL，细胞密度为（1.8～2.2）×106个/mL，病毒维持液为DMEM，培养温度为甲型34.5℃、乙型33.5℃，检测病毒血凝效价、病毒滴度（CCID50）和血凝素（hemagglutinin,HA）含量。结果 在5 L及50 L生物反应器中培养MDCK细胞，活细胞密度均可在72 h后达到8.0×106个/mL，活率在95%以上；H1N1、H3N2、BV、BY的血凝效价分别为7、11、9、9 log2(HAU/25μL),CCID50均达6.5以上，HA含量分别为20、40、35、40μg/mL。结论 成功建立了MDCK细胞和流感病毒的无血清全悬浮培养工艺，为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础。
2022年09期 v.35 1082-1089页 [查看摘要][在线阅读][下载 1578K] [下载次数：590 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 年悬悬;周辉;李军英;张家友;杨晓明;
目的 建立乙型（B/Yamagata和B/Victotria系）流感病毒荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法，并进行验证及初步应用。方法 根据乙型流感病毒（B/Yamagata和B/Victotria系）血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸（neuraminidase,NA）遗传差异，构建含B/Yamagata系流感病毒HA(120 bp)、NA(122 bp)及含B/Victotria系流感病毒HA(147 bp)和NA(141 bp)目的序列的重组标准品质粒，并设计特异性引物和探针，绘制标准曲线，建立qRTPCR检测方法。验证该方法的灵敏度、特异性和重复性，并利用建立的方法检测不同年份乙型流感病毒疫苗株和临床分离的季节性乙型流感病毒。结果 B/Yamagata系病毒（HA和NA序列）获得的标准曲线方程为Y=-3.370 1 X+41.061,R2=0.996,B/Victotria病毒（HA和NA序列）获得的标准曲线方程为Y=-3.318 85 X+40.952,R2=0.996。该方法具有高度特异性，能够区分乙型流感病毒，对甲型流感病毒（A/H1N1和A/H3N2）均无特异性扩增；灵敏度达每个反应10拷贝/μL。该方法可鉴别2018年乙型流感流行株及在MDCK细胞或鸡胚上传代培养的疫苗株，并进行了病毒载量的定量。结论 成功建立了乙型流感病毒qRT-PCR检测方法，各项验证参数均可满足检测要求，为乙型流感病毒感染的早期诊断、定量检测及其流行病学调查提供了可行的技术支持。
2022年09期 v.35 1090-1095+1101页 [查看摘要][在线阅读][下载 1350K] [下载次数：886 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 王灵;李梦诗;徐莎;陈国栋;王越;
目的 建立切向流过滤结合超速离心分离小细胞外囊泡的方法，以期提升小细胞外囊泡的分离效率。方法使用切向流过滤结合超速离心的方法分离小细胞外囊泡，并通过透射电镜观察、纳米颗粒追踪、Western blot等技术对分离的囊泡进行鉴定。结果 通过该方法分离的小细胞外囊泡直径主要分布在30～250 nm之间，透射电镜下可明确观察到囊泡样结构，纯化后的细胞外囊泡CD9、CD63和ALIX蛋白呈阳性表达，分离时间较常规超速离心方法明显缩短。结论 切向流过滤结合超速离心能够有效分离小细胞外囊泡，提升分离效率。
2022年09期 v.35 1096-1101页 [查看摘要][在线阅读][下载 1396K] [下载次数：560 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 孙博;刘晓晖;马达;原秀娟;闫慧;刘新涛;张海红;谷铁军;吴婷婷;
目的 建立重组腺病毒疫苗插入基因表达产物的鉴别方法，并进行验证。方法 采用Western blot法对重组腺病毒感染后的细胞上清液进行检测，鉴别插入基因表达产物是否表达。对方法的专属性和耐用性进行验证，并采用该方法鉴别3批重组腺病毒疫苗样品插入基因表达产物的活性。结果 重组腺病毒疫苗插入基因表达产物能被黏蛋白1-生存素[mucin 1(MUC1)-Survivin]的两种抗体分别识别，在相对分子质量约37 000处可见特异性条带，大小和组成与实际值相符，方法的专属性和耐用性均符合要求。3批重组腺病毒疫苗插入基因表达产物也均能被MUC1-Survivin的两种抗体分别识别，在相对分子质量约37 000处可见特异性条带，而阴性对照不能被识别。结论 采用Western blot法检测插入基因表达产物的活性，专属性和耐用性均较好，适用于重组腺病毒疫苗产品的鉴别试验，可为疫苗制备过程中的质量控制及产品检定提供参考。
2022年09期 v.35 1102-1106+1117页 [查看摘要][在线阅读][下载 1293K] [下载次数：368 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 马环;汪运洋;王晨;王珣;周第;陈兴;潘海龙;
目的 制备纳米氢氧化铝佐剂，并分析其相关性质。方法 优化现有氢氧化钠法制备佐剂工艺，获得纳米级氢氧化铝佐剂后，对其吸附率、沉降率、粒径分布、zeta电位及pH变化、扫描电镜特性进行检测。结果 所得氢氧化铝佐剂吸附率大于98%，沉降率为0，粒径分布范围小于100 nm,zeta电位约为30 mV,pH变化范围相对稳定。结论经优化后工艺可获得纳米级氢氧化铝佐剂，且性质优于原有微米级氢氧化铝佐剂。
2022年09期 v.35 1107-1111页 [查看摘要][在线阅读][下载 1318K] [下载次数：871 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张生琰;王玢;邵志伟;陈卓涛;杨林鹏;谢忆;李薇;雷清;杨俊杰;
目的 响应面法优化高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺条件。方法 以均质压力（A）、均质次数（B）、均质酵母质量分数（C）3个因素为影响因素，酵母细胞破碎率（Y）为响应值，应用Design-Expert软件，根据Box-Behnken中心组合试验设计方案，用响应曲面法建立二阶数学模型，确定最佳破碎工艺参数，基于二次多项式回归模型建立设计空间，并进行规模化工艺验证。结果 方差分析结果显示，模型P <0.01，且失拟值> 0.05，表明模型与检测结果拟合较好。最终获得的操作空间为：均质压力1 125～1 200 bar，均质次数3～4次，均质酵母质量分数12%。3批重组汉逊酵母细胞发酵液中酵母细胞破碎率均达到65%以上，该值在响应值设计空间范围内。结论 响应面法优化的高压均质破碎重组汉逊酵母细胞的工艺具有较好的稳健性和适应性。
2022年09期 v.35 1112-1117页 [查看摘要][在线阅读][下载 1475K] [下载次数：502 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 郭东华;肖佳薇;王丽娜;汪锋锋;贺显晶;蒋剑成;孙东波;
目的 制备坏死杆菌（Fusobacterium necrophorum）白细胞毒素（leukotoxin）PL2蛋白单克隆抗体，并鉴定其生物学特性。方法 原核表达并纯化坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白，腹腔注射免疫BALB/c雌性小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，并用GST标签蛋白对阳性孔进行二次反向筛选，针对亚克隆后稳定分泌PL2蛋白单克隆抗体的细胞株制备腹水，对单克隆抗体进行抗体效价检测、抗体亚类和Western blot鉴定及杂交瘤染色体分析。结果 成功筛选出1株稳定分泌坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2D5；杂交瘤细胞培养上清和腹水效价分别为1∶6 400和1∶105；单克隆抗体重链为IgG3，轻链为κ链；杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别可与坏死杆菌培养液浓缩上清和重组PL2蛋白发生特异性反应，且与GST标签蛋白无反应；杂交瘤细胞染色体数目为102条，与预期一致。结论 成功制备了牛坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白单克隆抗体，为坏死杆菌白细胞毒素致病机制的研究提供了工具。
2022年09期 v.35 1118-1122+1127页 [查看摘要][在线阅读][下载 1436K] [下载次数：242 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 麻芯茹;徐闯;杨威;张冰冰;
CD4~+T淋巴细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞之一，主要分为Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞（T f ollicular helper cells,Tfh）及调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）。CD4~+T淋巴细胞功能取决于T细胞受体（T cell receptor,TCR）,TCR的激活触发了内质网释放Ca~(2+),Ca~(2+)作为细胞的第二信使，通过改变其在细胞内外的浓度来参与细胞周期进展和增殖等多个生物活动过程，以维持免疫细胞的正常功能。CD4~+T淋巴细胞与脂肪肝、肝脂沉积、肝炎、肿瘤等多种疾病的发生发展有关。因此，本文就细胞内Ca~(2+)对CD4~+T细胞免疫功能调控作用的研究进展作一综述，以期为某些疾病新临床治疗方案的研发提供参考。
2022年09期 v.35 1123-1127页 [查看摘要][在线阅读][下载 1300K] [下载次数：322 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 臧成昊;杨金伟;郭建辉;李力燕;
肠道是人体消化系统中重要的组成部分，也是人体中微生物群最集中的部位，肠道菌群对肠道功能至关重要。肠道菌群与人体之间保持着动态平衡，若肠道菌群失调，人体会发生腹泻、便秘等疾病。肠道损伤是各种应激因素导致的肠道结构损伤和功能紊乱，在生活中普遍存在。间充质干细胞是一种多能干细胞，可进行自我更新和多向分化，分为骨髓间充质干细胞、人脐血带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞，具有免疫调节作用，可作为肠道损伤的新型治疗手段。本文就间充质干细胞对肠道损伤及其修复过程中肠道菌群的影响作一综述。
2022年09期 v.35 1128-1132页 [查看摘要][在线阅读][下载 1307K] [下载次数：523 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 井汇源;段二珍;
病毒通过进化可在细胞内实现自身基因的高效表达，并激活免疫反应，使其成为疫苗研发中抗原的理想递送载体。由于甲病毒载体能够稳定携带外源基因，且诱导插入突变的概率极低，已成为重要的病毒载体疫苗平台。基于甲病毒载体的兽用疫苗在动物体内可产生良好的免疫效果，该载体上存在甲病毒RNA聚合酶的基因，可模拟病毒复制，因此携带的抗原基因在表达量、持续时间、免疫效果方面均优于亚单位疫苗、灭活疫苗和传统的DNA/RNA疫苗。根据抗原递送的策略和依赖的启动子不同，可将基于甲病毒载体的疫苗分为质粒型DNA疫苗（plasmid DNA-based vaccine）、自我复制型mRNA疫苗（self-amplifying mRNA vaccine,SAM）和病毒样囊泡疫苗（viruslike vesicles vaccine,VLV），其中VLV克服了核酸疫苗面临的不稳定性和体内递送效果不佳的难题。本文就基于甲病毒载体的兽用疫苗的研究进展作一综述，以期为新型兽用疫苗的研发提供借鉴。
2022年09期 v.35 1133-1137页 [查看摘要][在线阅读][下载 1336K] [下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 曹阳;高洁;王辉;翟丽丽;
肿瘤细胞代谢活跃，需消耗大量的能量和营养以支持细胞的快速生长，肿瘤细胞和肿瘤血管上皮细胞中高度表达各种转运蛋白以增加营养的吸收。在恶性肿瘤细胞中，白蛋白结合蛋白（albumin-binding proteins,ABPs）负责白蛋白的摄取、转运、累积或再利用，与肿瘤形成、浸润和转移密切相关，有望作为肿瘤治疗或药物开发的新靶点。目前，在各种组织细胞中已陆续发现了7种ABPs,ABPs在肿瘤细胞中的功能和作用机制也逐渐成为研究热点。因此，本文就ABPs在肿瘤细胞中功能及抗肿瘤药物中应用的研究进展作一综述。
2022年09期 v.35 1138-1142页 [查看摘要][在线阅读][下载 1374K] [下载次数：379 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 曾庆想;李淳伟;李婵;徐绍坤;
干细胞是一类具有无限自我更新能力的细胞，可分化成多种功能细胞，因此已广泛应用于细胞替代治疗、系统重建、组织工程、基因治疗及美容抗衰老等方面的研究，应用前景广阔。标准化是组织现代化生产的重要手段和必要条件，是科研、生产、应用三者之间的桥梁。各国在不断加强对干细胞技术深入研究的同时，也已开启了干细胞相关标准化研究工作。本文就干细胞技术的应用和市场发展现状及干细胞领域标准化研究进展情况作一综述，以期为行业相关从业人员提供参考。
2022年09期 v.35 1143-1148+1152页 [查看摘要][在线阅读][下载 1426K] [下载次数：1865 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]