- 张名;冯昌增;刘红波;王晓辉;许丹菡;丛山日;何陆涛;张光贤;马绍辉;
目的 分析2015年云南省4株柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6,CV-A6）分离株的全基因组特征。方法 取手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患儿粪便样本，制备悬液，接种至人横纹肌肉瘤细胞，CV-A6致细胞病变（CPE）后，收集病毒液，提取RNA，经RT-PCR分段扩增获得全基因组片段，并进行测序。采用Geneious9.1. 4和Mega 7.0、Simplot等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列比对、系统进化及重组分析，并构建系统进化树。结果 4株CV-A6分离株之间核苷酸和氨基酸序列一致性分别为94.8%～97.9%和97.3%～98.4%，与近几年国内流行的CV-A6株核苷酸和氨基酸序列一致性分别为94.6%～97.9%和97.4%～99.1%；分离株在5′UTR、2A、2C、3A、3D、3′UTR区可能存在与毒力和临床表型相关的12个位点。结论 4株云南分离株属于CV-A6血清型，为D3a基因亚型。
2022年08期 v.35 922-927页 [查看摘要][在线阅读][下载 998K] [下载次数：172 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李军丽;付丽丽;杨阳;王国治;赵爱华;
目的 初步探讨新型生物佐剂BC01(BCG CpG DNA compound adjuvant system 01)对机体的免疫激活作用。方法 将C57BL/6小鼠随机分为4组并分别肌肉注射75μg新型生物佐剂BC01，实验组于免疫后6、12和24 h解剖取脾脏，对照组于注射BC01后0 h解剖取脾脏。提取各组小鼠总RNA并进行全基因转录组分析。基因芯片数据经归一化处理后进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）。同时，采用实时定量PCR法对GSEA中GO(gene ontology,GO)基因集分组归类中生物过程（biological process,BP）、细胞成分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）相关上调基因进行验证分析。结果 小鼠全基因转录组芯片数据经GSEA分析后发现，BC01佐剂具有活化免疫细胞，激活固有免疫和适应性免疫应答，调节炎症反应、活化免疫细胞迁移与趋化，激活免疫细胞吞噬功能以及促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular-regulated kinase 1/2,ERK1/2)信号级联反应作用。结论 新型生物佐剂BC01经肌肉注射24 h后具有较强的机体免疫激活作用。
2022年08期 v.35 928-936+942页 [查看摘要][在线阅读][下载 1696K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨洵;金佳佩;马家秀;卢卉双;蔡雪飞;
目的 可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)刺突蛋白受体结合域（recepter binding domain,RBD），并对其进行功能鉴定。方法 利用生物信息软件对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区DNA序列中的稀有密码子进行替换优化。人工合成优化的RBD DNA全序列，插入p GEX 6P-1原核表达载体，构建重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD，转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞，IPTG诱导表达重组RBD蛋白，并进行亲和层析纯化。采用SDS-PAGE、Western blot、Pull-down试验鉴定重组RBD蛋白，并应用其检测康复期患者的血清中和抗体。结果 优化后RBD基因序列在大肠埃希菌中的表达难易值（CAI）由0.215提高至1.0；重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD经菌落PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确；获得的重组RBD蛋白为相对分子质量约60 000的可溶性蛋白，纯度约为82%，能与血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)发生特异性结合，并能测定康复期患者血清中的特异性抗体，且灵敏度较好。结论 成功获得了可溶性的重组RBD蛋白，该重组蛋白具备与人ACE2受体结合的功能，可用于中和抗体测定和疫苗接种后的效果评估。
2022年08期 v.35 937-942页 [查看摘要][在线阅读][下载 1312K] [下载次数：264 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨文腰;韩镌竹;廖辉;修雪亮;张建;侯雅丹;周荔葆;
目的 筛选耐受抗生素种类多、毒力强、免疫原性好、安全性高及副反应小的奇异变形杆菌（Proteus mirabilis,PM），为预防用疫苗的生产提供生产用菌株。方法 选择31株PM，通过检测抗生素耐药性、毒力，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）抗原的免疫原性、安全性及毒性筛选候选菌株，进一步评价其多价抗原对候选株的保护性和同种属其他菌株的交叉保护性。结果 大部分PM具有多重耐药性，对四环素、氯霉素的耐药性分别为83.87%和87.09%，但对亚胺培南、头孢噻肟敏感，仅为3.23%和29.03%，其中耐受4种以上抗生素的占57%。筛选出9株毒力较强的候选菌株。盐酸羟胺在位消化最佳时间在66～72 h之间，LPS抗原含量达到稳定，为1.150 mg/mL。候选株LPS抗原的免疫原性均低于10μg/mL；安全性符合要求；毒性试验LD50除PM15(0.379 mg/mL)、PM100(0.594 mg/m L)和PM109(0.424 mg/mL)外，其余菌株均不低于0.6 mg/mL;Dienes试验表明，6株PM均属于不同菌株。LPS多价抗原对候选株的保护率达70%以上，对PM其他菌株的交叉免疫保护率分布在20%～90%之间，50%以上的占77.78%。结论 6株PM候选株LPS多价抗原对候选株具有保护性，也对PM其他菌株具有交叉保护性，为后续PM医院获得性感染的预防研究提供了数据支持。
2022年08期 v.35 943-948页 [查看摘要][在线阅读][下载 1152K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 贺蕾;包小华;李相梅;周晶莹;褚彦飞;孙博;谷铁军;
目的 确定原核表达系统中人类乳头瘤病毒6型（human papillomavirus 6,HPV6）L1蛋白的最佳表达条件，并对HPV6 L1 VLP免疫小鼠后产生的中和抗体水平进行评价。方法 将密码子优化的HPV6 L1基因片段与原核表达载体pET30a（+）连接，构建重组表达质粒pET30a-6L1，在大肠埃希菌中表达HPV6 L1蛋白，并通过添加分子伴侣（TF、GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE）筛选能够增加目的蛋白表达的最佳条件。将表达的HPV6 L1蛋白经密度梯度离心、阳离子交换层析后获得纯化蛋白，对其形态进行表征。将纯化的HPV6 L1 VLP免疫BALB/c小鼠，采用假病毒中和试验检测小鼠血清中和抗体水平。结果 质粒pET30a-6L1经双酶切鉴定证明构建正确；添加TF分子伴侣时HPV6 L1蛋白表达量最高；HPV6 L1 VLP是呈均一的、直径45～65 nm的球状结构，与HPV6天然病毒颗粒的形态、大小相似；HPV6 L1 VLP初次免疫小鼠第8周，血清抗体水平达到峰值，为105以上。结论 分子伴侣TF促进了HPV6 L1蛋白的可溶性表达，纯化后的目的蛋白免疫原性良好。本研究为后续各型别HPV L1蛋白表达工艺的探索提供了思路，也为下一步的中试扩大培养奠定了基础。
2022年08期 v.35 949-953+959页 [查看摘要][在线阅读][下载 1237K] [下载次数：251 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李璇;马伟雄;陈文璞;汤金荣;俞国锋;陈忠;
目的 检测前列腺癌组织和细胞中富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白1(cysteine and glycine-rich protein 1,CSRP1)的表达水平，并探讨其表达对前列腺癌细胞侵袭转移的影响及其机制。方法 采用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR分别检测前列腺癌组织和细胞系（PC-3和LNCaP）中CSRP1的表达；将CSRP1基因小干扰RNA转染PC-3细胞，下调细胞中CSRP1的表达，采用Transwell小室试验和划痕试验分别检测PC-3细胞的侵袭和迁移能力，Western blot法检测内皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志物E-cadherin和Vimentin的表达水平。结果CSRP1在前列腺癌组织中呈高表达；与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比，CSRP1在2种不同的前列腺癌细胞系中表达水平显著升高（P <0.05）。干扰CSRP1表达后，PC-3细胞的侵袭和迁移能力显著减弱（P <0.05），且E-cadherin的表达水平显著升高（P <0.05）,Vimentin的表达受到抑制（P <0.05）。结论 CSRP1在前列腺癌组织和细胞系中表达上调。沉默CSRP1表达后可下调Vimentin，逆转EMT的发生，从而抑制前列腺癌细胞的侵袭转移。CSRP1可能是前列腺癌的治疗靶点和潜在的诊断标志物。
2022年08期 v.35 954-959页 [查看摘要][在线阅读][下载 1391K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 曹飞婷;邹阳;方利;
目的 构建抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)纳米抗体文库，筛选抗小鼠IgG的纳米抗体，并制备小鼠IgG的特异性亲和层析介质。方法 以小鼠IgG为靶点，构建纳米抗体文库，利用噬菌体筛选技术对纳米抗体文库进行筛选。得到的纳米抗体经重组表达和纯化后制备成小鼠IgG亲和层析介质，并利用小鼠血清进行测定和验证。结果 构建了多样性好且库容量达2.3×107cfu的初始文库，经3轮淘选后，共筛选出4条有结合活性的纳米抗体序列，其中纳米抗体2E2经预活化填料偶联后，对小鼠IgG载量可达18.55 mg/mL，可用于小鼠IgG的纯化和检测。结论 利用噬菌体筛选技术成功筛选出抗小鼠IgG的纳米抗体，并制备出特异性亲和小鼠IgG的亲和层析介质。
2022年08期 v.35 974-980页 [查看摘要][在线阅读][下载 1563K] [下载次数：638 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 江征;刘悦越;朱文慧;沈泓;李炎;郭航炜;王剑锋;英志芳;王晓娟;李长贵;
目的 建立与国际接轨的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine made from Sabin strain,sIPV）Vero细胞残余DNA荧光定量PCR(q-PCR)检测方法及相应质量标准。方法 按照《中国药典》三部（2020版）通则3407第三法，选择通则建议的Vero细胞核酸引物和探针，通过优化磁珠法提取核酸以及PCR反应体系和条件，采用q-PCR法Vero细胞DNA定量国家标准品，对sIPV产品进行线性范围、精密度和回收率验证。在此基础上，与国内5家sIPV生产研究企业和2家省药检院协作开展适用性验证的研究，并对检测结果进行统计分析，建立qPCR法检测sIPV成品Vero细胞DNA残留量的可接受限度标准。结果 优化的q-PCR方法在0.002～200 pg/μL范围内呈良好的线性关系，R2=0.999；精密度验证结果试验内、试验间变异系数分别为16.7%和27%；样品回收率在50%～150%范围内，RSD≤30%，符合《中国药典》三部（2020版）通则3407第三法相关要求。协作研究各企业sIPV成品Vero细胞DNA残留量平均为0.07～7.8 pg/剂，检测结果最大值<50 pg/剂，各实验室显示出良好的适用性；用q-PCR法检测已知50 pg Vero细胞核酸标准品（杂交法用），共获得55个有效检测值，统计计算结果为50.00 pg(95%CI:44.00～56.01 pg)，与理论值差异无统计学意义（P> 0.05）。结论 成功建立了sIPV产品适用的Vero细胞残余DNA q-PCR检测方法，该方法具有良好的适用性，可用于sIPV成品的质量评价，限度标准定为不高于50 pg/剂具有可行性。
2022年08期 v.35 981-985+991页 [查看摘要][在线阅读][下载 1345K] [下载次数：283 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张爱菊;白莹;薛林科;戴兴德;张小林;董娜;
目的 建立血清过氧化氢酶（catalase,CAT）活度臧红T(safranine T,ST)荧光猝灭检测方法，并进行优化。方法 建立的方法分为酶促反应和荧光猝灭反应2个阶段，对荧光猝灭反应的催化剂（Fe~(3+)和Fe~(2+)）及其用量（0.00～1.20 m L）、ST用量（0～6 mL）、硫酸用量（0～6 mL）、荧光猝灭时间（2.5～60.0 min）及酶促反应的H_2O_2用量（0.00～3.00 mL）、酶促反应时间（0～30 min）进行优化。同时确定方法的线性范围，进行干扰试验，并验证准确性。结果 最佳检测条件：催化剂为Fe~(2+),Fe~(2+)用量为0.80 mL,ST用量为3.00 mL，荧光猝灭反应不需加入硫酸（pH范围为4.11～4.82），荧光猝灭时间为15 min;H_2O_2用量为1.00 mL，酶促反应时间为10 min。CAT活度在5×10-5～0.02 U/mL范围内，与△F呈良好的线性关系，线性方程为y=180 7 x+0.752 7,r=0.998 0；检测限为3.81×10~(-5)U/mL；检测体系中存在1×10~(-5)mol/L的Vc、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖时测定误差<5%;6份血清加标样品回收率为98.0%～102.0%。结论 建立的CAT活度ST荧光猝灭检测方法具有良好的准确性及较低的检测限，可用于临床人血清中CAT活度的检测。
2022年08期 v.35 986-991页 [查看摘要][在线阅读][下载 1370K] [下载次数：197 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨越;李雪娇;郭骐源;郭丹丹;郭轩麟;吴业红;
目的 建立MDCK细胞流感疫苗亲和层析工艺。方法 采用Cellufine Sulfate亲和层析柱纯化MDCK细胞流感病毒液，并对洗脱缓冲液盐浓度（0.5、1、1.5 mol/L NaCl）、线性流速（50、100、150 cm/h）及样品浓缩倍数（1、2、5倍）进行优化。采用优化方法连续上样40个柱体积，计算亲和层析结合HA的动态结合载量。采用优化方法检测3批MDCK细胞流感病毒液血凝素（hemagglatinin,HA）含量、宿主DNA残留量和宿主蛋白残留量，并计算HA回收率、宿主DNA去除率及宿主蛋白去除率。同时采用优化方法及分子筛层析Sepharose 4FF纯化同批MDCK细胞流感病毒液，比较纯化效果。结果 最佳洗脱缓冲液盐浓度为1.5 mol/L NaCl，线性流速为100 cm/h，样品浓缩倍数为5倍。最佳条件下纯化产物HA回收率为80%，宿主DNA去除率为99%，宿主蛋白去除率达80%以上。亲和层析结合HA的动态结合载量为2 072μg/mL介质。与分子筛层析Sepharose 4FF比较，Cellufine Sulfate亲和层析纯化样品HA回收率及DNA去除率均有提高，宿主蛋白去除率略有下降。结论 建立的MDCK细胞流感疫苗亲和层析工艺具有较高的杂质去除率，为细胞流感疫苗大规模纯化奠定了基础。
2022年08期 v.35 992-996页 [查看摘要][在线阅读][下载 1331K] [下载次数：474 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 魏文;王彦娜;吴明远;王建刚;
目的 探讨一种用于小体积注射液制剂装量的检测方法。方法 用移液器移液，计算每1 mL供试品[人白介素-12(human interleukin-12,hIL-12)]的重量（即供试品的相对密度），分析不同条件（实验员、温度、供试品批次、强制条件）对相对密度测定的影响，再通过供试品重量/相对密度计算装量。结果 hIL-12相对密度平均值为1.004 g/mL，不同条件下供试品相对密度测定结果的变异系数（CV）均小于2%，差异均无统计学意义（P> 0.05）。重量/相对密度计算装量的方法适用于hIL-12装量的测定，CV小于2%，且不同人员操作差异无统计学意义（P>0.05）。结论 采用重量/相对密度的方法，无需量筒和比重瓶，能够更快速、准确、真实地测定hIL-12等小体积注射液的装量，确保临床用药安全。
2022年08期 v.35 997-1001页 [查看摘要][在线阅读][下载 1266K] [下载次数：95 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 宋月爽;陈晓旭;潘东;卢井才;张立娜;刘禹壮;原秀娟;段盛博;袁若森;赵慧;
目的 建立呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）滴度的间接免疫荧光检测方法，并进行验证。方法 以Synagis(Palivizumab)为一抗，荧光标记羊抗人IgG为二抗，建立用于RSV滴度检测的间接免疫荧光法，并对HEp-2细胞接种密度（3×10~4、4×10~4、5×10~4、6×10~4、7×10~4、8×10~4个/孔）、细胞培养液中胎牛血清浓度（2.5%、5%、10%、20%）、病毒培养时间（20、24、26、30、38、48 h）、抗体稀释度[一抗：1∶（1 000/3）、1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000，二抗：1∶（400/3）、1∶400、1∶1 200]进行优化。验证方法的特异性、线性范围、准确性、重复性。结果 建立的方法最佳工作条件：HEp-2细胞接种密度为6×104个/孔，胎牛血清浓度为2.5%，病毒培养时间为24～26 h，一抗稀释度为1∶1 000，二抗稀释度为1∶400。RSV可见特异性荧光，狂犬病病毒、流感病毒、风疹病毒均未见荧光；RSV滴度理论值在1.70×10~7～5.43×10~3FFU/mL范围内，与检测值呈良好的线性关系，回归方程为y=1.031 3 x-0.250 8,R2=0.989 7；准确性验证回收率在70%～130%范围内；重复性验证RSD均≤15%。结论 建立的RSV滴度间接免疫荧光检测方法具有良好的特异性、准确性、重复性，且检测周期短，可用于RSV滴度快速检测。
2022年08期 v.35 1002-1005+1012页 [查看摘要][在线阅读][下载 1484K] [下载次数：827 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]