- 房凌旭;卢中一;
目的 通过构建点突变库探讨丝切蛋白（Cofilin）的氨基酸位点在烟曲霉抗逆性和致病力中的作用。方法 构建并筛选烟曲霉Cofilin点突变株；通过应激试验分析Cofilin点突变对烟曲霉抗氧化、抗高渗透压和抗细胞壁干扰等方面的影响；利用FITC偶联的伴刀豆蛋白荧光标记分析Cofilin点突变对烟曲霉细胞壁甘露糖合成及分布的影响；通过大蜡螟幼虫感染试验分析Cofilin点突变对烟曲霉致病力的影响。结果 构建的烟曲霉Cofilin点突变库包括单突变K26A、E56A和双突变D11A-E12A、K41A-K42A和R59A-R61A;D11A-E12A、K26A、E56A和R59A-R61A导致烟曲霉菌丝生长能力减弱；D19A-R21A和K36A导致烟曲霉对过氧化氢（H_2O_2）的耐受能力增强，而K36E使菌株对H_2O_2的耐受能力显著减弱；此外，K36A和E56A引起烟曲霉菌丝顶端的甘露糖聚集；D19A-R21A、K36A和K26A使烟曲霉对大蜡螟幼虫的致病力显著增强，而E56A和R59A-R61A导致菌株对大蜡螟幼虫的致病力显著减弱。结论Cofilin及其氨基酸位点在烟曲霉抗逆性和致病力等方面具有重要作用。
2022年07期 v.35 795-801页 [查看摘要][在线阅读][下载 1466K] [下载次数：113 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈耐寒;赵仁彬;孙鷖;李丽;郑永钦;左荣霞;张进萍;赵倩;沈涛;撒亚莲;
目的 探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSCs）对异体人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）增殖及其调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）亚群的影响。方法 用组织块贴壁法培养原代hUC-MSCs，经消化酶传代培养扩增细胞，获得第4代hUC-MSCs；经Ficoll密度梯度离心法获取PBMCs。将hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10的比例共培养，设单独培养的PBMCs为对照组，在培养体系中添加25 ng/mL植物血凝素（phytohaemagglutinin,PHA），培养5 d；采用全自动血液分析仪检测PHA活化PBMCs数量，流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127ddim/-Treg细胞表达水平。结果 hUC-MSCs为贴壁生长的梭形细胞，具有分化为成脂肪样细胞、成骨样细胞和成软骨样细胞的潜能。hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10比例共培养5 d，悬浮细胞数均少于单独培养组，hUC-MSCs抑制PBMCs增殖率分别为（81.54±5.10）%和（43.37±3.35）%;hUC-MSCs促进CD4+CD25+CD127ddim/-Treg细胞亚群增殖，上调效率分别为（41.73±4.66）%和（19.39±5.62）%，高于单独培养组。结论 h UC-MSCs在体外对PHA活化的异体人PBMCs有免疫负调节作用。
2022年07期 v.35 802-807页 [查看摘要][在线阅读][下载 1239K] [下载次数：377 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李德珍;冯翎;余洛潇;常国栋;
目的 探讨环状RNA(circRNA)hsa＿circ＿0004771基因干扰对骨肉瘤MG63细胞增殖和凋亡的影响。方法 用hsa＿circ＿0004771基因干扰序列（shRNA）及阴性对照序列（shRNA-NC）分别转染MG63细胞，同时设空白对照组（不转染）。EdU染色法检测细胞增殖情况；流式细胞术及Hoechst染色法检测细胞凋亡情况；流式分选法检测线粒体膜电位；相应试剂盒检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量；Western blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、c-Myc、蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较，shRNA组EdU阳性细胞数明显降低（P <0.05），细胞凋亡率明显升高（P <0.05），线粒体膜电位明显降低（P <0.05）,MDA及LDH含量显著升高（P均<0.05）,Bax/Bcl-2及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值明显升高（P均<0.05）,c-Myc蛋白表达水平显著降低（P <0.05）。结论 circRNA hsa＿circ＿0004771基因干扰可抑制骨肉瘤细胞MG63增殖，并诱导细胞凋亡，降低线粒体膜电位。
2022年07期 v.35 808-812页 [查看摘要][在线阅读][下载 1171K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 许丹菡;张捷;丛山日;张名;冯昌增;黄小琴;孙浩;杨昭庆;马绍辉;
目的 分析柯萨奇病毒A组10型毒株在人胚肺二倍体细胞（KMB17）上增殖的遗传稳定性。方法 将V6-19/XY/CHN/2017毒株适应于KMB17细胞，并连续传代培养至15代。分别提取适应前及适应后第5、10、15代病毒RNA，分段对全基因组序列进行RT-PCR扩增、测序及拼接，利用Maga 7.0、Geneious 6.1. 4等软件进行系统进化及同源性分析。结果 命名该KMB17细胞适应株为K6-19/XY/CHN/2017，各子代病毒感染性滴度为7.25～7.75 lgCCID50/mL。适应前后4个子代病毒的全基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.99%～100%和99.95%～100%。适应前与适应后第5、10代毒株均无核苷酸和氨基酸序列突变，第15代毒株VP4区域发生1个核苷酸突变（VP4 172 A→G）及1个氨基酸突变（VP4 58 Ile→Val）。结论 CV-A10能较好地适应KMB17细胞，K6-19/XY/CHN/2017在KMB17细胞上适应后可保持较高的病毒滴度和遗传稳定性，为后续疫苗研发奠定了实验基础。
2022年07期 v.35 813-817页 [查看摘要][在线阅读][下载 1215K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 郎艺洁;王云龙;李玉林;王继创;王旭东;王晓军;周丽;钱鹏;
目的 比较层析介质Capto Core400和Sephacryl S-1000纯化乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein,HBc）病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）的效果。方法 采用两种层析介质纯化相同3批HBc VLPs蛋白粗提液，BCA法检测纯化样品的蛋白浓度，计算蛋白回收率；体积排阻色谱法检测纯度；马尔文粒径仪检测HBc VLPs粒径；透射电子显微镜观察HBc VLPs形态。结果 层析介质Sephacryl S-1000和Capto Core400纯化HBc VLPs的蛋白回收率分别为75.5%和70.5%，蛋白纯度分别为87%和99%，粒径大小均为（30±4）nm，均一性良好；与Sephacryl S-1000比较，经Capto Core400纯化的HBc VLPs分布更均匀。结论 Capto Core400纯化HBc VLPs的纯度及颗粒分布均匀性更佳，且该层析介质装量小，纯化时间短，更适用于HBc VLPs的规模化生产。
2022年07期 v.35 818-821页 [查看摘要][在线阅读][下载 1188K] [下载次数：254 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 白海涛;刘伟江;袁福临;李雪;王洋;刘元林;王振山;张毅;
目的 探讨鸟苷酸结合蛋白2(guanylate binding protein 2,GBP2)对人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell,hUC-MSC）成骨分化的调控作用。方法 培养hUC-MSC，采用吉姆萨染色、流式细胞术及体外诱导分化等方法对hUC-MSC生物学特性进行鉴定；构建过表达GBP2的慢病毒载体，转染hUCMSC，荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率，实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,q-PCR)法检测转染后hUC-MSC中GBP2的表达，获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2~(high)hUC-MSC)；采用流式细胞术和体外诱导分化试验检测GBP2~(high)hUC-MSC的生物学特性，油红O染色评价体外成脂分化能力，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色评估成骨分化能力，q-PCR法检测成脂和成骨分化相关转录因子的表达。结果 培养的hUCMSC的细胞形态、细胞表型和诱导分化均符合MSC国际金标准。经GBP2慢病毒载体转染的hUC-MSC中GBP2的表达显著增加，获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2~(high)hUC-MSC)。GBP2~(high)hUC-MSC的细胞形态和细胞表型以及体外成脂分化能力均未发生变化，但成骨分化能力发生改变，GBP2~(high)hUC-MSC组ALP染色明显高于hUC-MSC组，成骨分化关键转录因子OPN和ALP的表达也显著高于hUC-MSC组（P均<0.05）。结论 GBP2可促进hUCMSC的成骨分化，并上调成骨标志基因OPN和ALP的表达。
2022年07期 v.35 822-828+835页 [查看摘要][在线阅读][下载 1637K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 顾建阳;王宇;孙子琪;张雯雯;常军亮;
目的 制备重组人干扰素α2b(recombinant human interferon α2b,rhIFNα2b)单克隆抗体的亲和层析介质，并评价其纯化效果。方法 采用小鼠杂交瘤细胞融合技术及小鼠体内诱生法筛选并制备rhIFNα2b单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb），经AT Protein A亲和层析纯化，12%还原型SDS-PAGE鉴定纯度，Western blot法鉴定McAb与rhIFNα2b原液及其聚合蛋白（rhIFNα2b原液于56℃热加速处理）的特异性反应。用筛选的McAb与CNBr-activated BestaroseTM4FF偶联1～4 h，紫外-可见分光光度法监测偶联液上清McAb蛋白浓度，12%还原型SDS-PAGE验证偶联介质抗体蛋白饱和程度，确定最佳偶联时间。将制备的McAb亲和层析介质装柱后，上样rhIFNα2b原液及经56℃热加速24 h的样品，15%非还原SDS-PAGE验证其纯化效果。结果 经杂交瘤制备和筛选，确定以4E2抗体作为偶联McAb，纯度> 95%。McAb 4E2与CNBr-activated BestaroseTM4FF偶联3 h后抗体蛋白浓度趋于平稳，预活化凝胶介质抗体蛋白吸附率约为30 mg/mL，凝胶介质偶联抗体蛋白量趋于饱和，为使偶联更加充分，确定最佳偶联时间为4 h。rhIFNα2b原液及其56℃热加速24 h样品可由McAb亲和柱层析有效吸附洗脱，并保持与McAb的结合活性。结论 本实验制备的rhIFNα2b单克隆抗体亲和层析介质，具有良好的纯化效果，为rhIFNα2b不同剂型比对样品的前处理提供了高效方法。
2022年07期 v.35 844-847+852页 [查看摘要][在线阅读][下载 1338K] [下载次数：486 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：2 ] - 刘微;戴凌燕;苗青;彭辉;张东杰;李志江;
目的 建立一种经济高效、结果稳定的酵母菌落PCR模板DNA制备方法。方法 将乙酸乙酯处理与高温破壁相结合，建立乙酸乙酯-高温破壁法制备酵母菌落PCR模板DNA，并以此方法对酵母进行目的基因扩增与阳性转化子的筛选。同时，以酵母基因组DNA及高温破壁法制备的模板作为对照。结果 乙酸乙酯-高温破壁法制取的模板可直接用于菌落PCR扩增目的基因片段以及筛选阳性转化子，与提取酵母基因组DNA相比，采用乙酸乙酯-高温破壁法制取模板的准确率可达90%以上，而高温破壁法制备模板结果不稳定。结论 本实验建立的方法简单高效，结果稳定，成本低廉，可满足大规模筛选阳性转化子。
2022年07期 v.35 848-852页 [查看摘要][在线阅读][下载 1369K] [下载次数：743 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 施歌;石亮;王翠艳;白鹭;褚彦飞;史赫;谷铁军;刘大维;包小华;
目的 建立定量检测肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗抗原含量的检测方法，并进行验证。方法 用EV71 VLP抗原免疫日本大耳白兔，制备多克隆抗体，并进行Protein A亲和层析纯化。以纯化的抗EV71 VLP多克隆抗体为包被抗体，筛选最佳包被浓度及酶标抗体稀释倍数，建立定量检测EV71VLP抗原含量的双抗体夹心ELISA法，并对该方法进行准确度、精密度验证，确定方法的线性范围和定量限。结果抗EV71多克隆抗体包被浓度5μg/mL，酶标抗体稀释度1∶10 000条件下，建立了检测EV71 VLP抗原含量的双抗体夹心ELISA法。抗原标准品浓度在0.5～8 U/mL范围内，其对数值与对应的A450值对数值呈良好的线性关系，R2=0.992 7，定量限为2 ng/mL；准确度验证回收率为81%～106%；精密度验证相对标准偏差（RSD）为4.96%～12.04%。结论 建立了用于EV71 VLP抗原定量检测的双抗体夹心ELISA法，有望用于EV71 VLP疫苗抗原含量的初步检测。
2022年07期 v.35 853-857页 [查看摘要][在线阅读][下载 1331K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 郭晶晶;宋晓红;刘华擎;陈秋兰;张颖;王洁如;
目的 建立一种基于聚合物分析系统（Aggregates Sizer）的流感疫苗裂解效果检测方法，并进行方法验证。方法将流感病毒裂解疫苗原液A（由裂解液制得，病毒颗粒已裂解）和B（由裂解前纯化液制得，病毒颗粒未裂解）按一定比例混合，配制成裂解程度为60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液，经Aggregates Sizer检测样本中各粒径病毒颗粒的分布丰度和累积分布丰度，以流感病毒颗粒裂解程度为横坐标，颗粒累积分布丰度为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线方程，计算相关系数（r2）。另取60%、80%和100%裂解程度的工作液作为质量控制（quality control,QC）样本，重复检测3次，准确性以相对误差（relative error,RE）表示，精密性以相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）表示。结果 工作液在60%～100%裂解程度范围内与病毒颗粒累积分布丰度呈良好线性关系，标准曲线方程为y=-2 600 x+2 610,r2为0.995。不同裂解程度QC样本经3次检测的RE均<2%,RSD均<0.05%。结论 建立了基于Aggregates Sizer系统的流感疫苗裂解效果检测方法，该方法具有良好的准确性和精密性。
2022年07期 v.35 858-860+866页 [查看摘要][在线阅读][下载 1335K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]