- 唐剑光;张健锋;常东英;曹玉锋;乔宏雷;高洪喜;迟春萍;
目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A_(600)至3. 5左右时加入终浓度为0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl_2、0. 5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29. 2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97. 32%,比活为5. 08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。
2020年06期 v.33 614-618页 [查看摘要][在线阅读][下载 752K] [下载次数：631 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李洁;李萍;李海霞;魏静;阎春生;哈小琴;
目的探讨NOD样受体家族3(NOD-like receptor family 3,NLRP3)炎性体对氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)诱导的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)焦亡(pyroptosis)的调控作用。方法将H9c2(2-1)细胞分别经不同浓度TMAO处理不同时间,CCK-8法检测细胞存活率,确定最适TMAO处理浓度。在此浓度条件下,TMAO分别处理H9c2(2-1)细胞24、48及72 h,同时设对照组(未经TMAO处理的细胞),采用RT-PCR及Western blot检测H9c2(2-1)细胞中NLRP3、白细胞介素-1β(IL-1β)及胱天蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA转录和蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞焦亡并确定焦亡时间点。于TMAO组及对照组中加入NLRP3抑制剂MCC950,处理H9c2(2-1)细胞至焦亡时间点,采用同样方法检测相关指标的变化情况,以验证TMAO的促炎作用及NLRP3炎性因子对TMAO诱导的H9c2(2-1)细胞焦亡的调控作用。结果与对照组比较,300μmol/L TMAO处理H9c2(2-1)细胞后,24、48及72 h细胞存活率差异无统计学意义(P> 0. 05);48 h开始焦亡细胞数显著增加(P <0. 05),细胞中NLRP3、IL-1β及Caspase-1 m RNA转录和蛋白表达水平均显著升高(P均<0. 05)。加入MCC950 48 h,经TMAO处理的H9c2(2-1)细胞焦亡显著减少(P <0. 05),NLRP3、IL-1β及Caspase-1 mRNA转录和蛋白表达水平均显著降低(P均<0. 05)。结论 TMAO处理的H9c2(2-1)细胞促进了NLRP3炎性体的激活,出现炎症反应,导致H9c2(2-1)细胞焦亡,而抑制NLRP3可减轻TMAO诱导的炎症反应,减少H9c2(2-1)细胞焦亡。
2020年06期 v.33 619-625页 [查看摘要][在线阅读][下载 1258K] [下载次数：587 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 裴德宁;史新昌;秦玺;陶磊;饶春明;
目的比较鸡胚成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人羊膜细胞(WISH细胞)培养水疱性口炎病毒(vescular stomatitis virus,VSV)的效果。方法将VSV分别按250、300、350 TCID_(50)/0.1 mL感染鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞,比较3种细胞培养的VSV的滴度及液氮中保存3、6、12个月的稳定性。结果鸡胚成纤维细胞、Vero细胞和WISH细胞培养的VSV的滴度分别为(10~(6.21)±10~(0.07))、(10~(5.21)±10~(0.07))和(10~(4.88)±10~(0.12) TCID_(50)/0.1 mL。用鸡胚成纤维细胞培养的VSV放置12个月稳定性较高,而用Vero细胞和WISH细胞培养的VSV稳定性较低,滴度分别为(10~(5.75)±10~(0.12)、(10~(4.08)±10~(0.07))和(10~(3.62)±10~(0.12) TCID_(50)/0.1 mL。结论使用鸡胚成纤维细胞培养的VSV具有较高的滴度和稳定性,是实验室培养VSV的首选方法。
2020年06期 v.33 626-628页 [查看摘要][在线阅读][下载 760K] [下载次数：314 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张亚萍;王斌;牛丹;陈思羽;闫文鹏;申宁宁;张晓琴;魏荣;王晨;李灵敏;
目的构建APC膜结合蛋白1(APC membrane recruitment protein 1,AMER1)基因不同区域片段重组质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增AMER1基因不同功能区域片段2-1135AA、2-327AA、2-785AA、327-785AA、785-1135AA及327-1135AA,扩增片段分别经T4 DNA酶与EGFP-N1载体连接,构建AMER1不同功能片段重组质粒,产物分别转化至感受态E. coli DH5α中,提取阳性克隆进行双酶切及测序鉴定;用脂质体2000介导各重组质粒转染肺腺癌A549细胞,同时设转染空载体EGFP-N1为对照组,q-PCR法检测AMER1不同功能区域片段m RNA转录水平。结果经双酶切及测序鉴定,AMER1不同功能区域片段重组质粒构建正确;与对照组比较,A549细胞中6个重组质粒AMER1基因m RNA转录水平均显著升高(P均<0. 01)。结论成功构建了AMER1基因不同功能片段截短子重组质粒,并在A549细胞中高表达,为进一步研究AMER1不同功能区域在肺腺癌中的作用及相关分子机制提供了生物学工具。
2020年06期 v.33 629-633+639页 [查看摘要][在线阅读][下载 1348K] [下载次数：168 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 马伟;曹方;郭阳漾;王丹雅;杨欢;
目的对本公司制备的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白进行结构确证分析。方法通过发酵、提纯制备3批CRM197蛋白,经N-末端序列、C-末端序列、质量肽图和肽段覆盖率分析进行一级氨基酸序列结构确证分析,经圆二色谱法进行二级蛋白结构确证分析。结果 3批CRM197蛋白N-末端均为GADDVVDSSK,C-末端均为FEIKS,质量肽图的紫外图谱高度一致,肽段覆盖率为100%,一级结构与标准CRM197蛋白氨基酸序列完全一致。3批CRM197蛋白二级结构测算值比例差异不大,批间稳定。结论本公司自制的3批CRM197蛋白与标准CRM197蛋白结构基本一致,为研制以CRM197为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗及其产业化生产奠定了基础。
2020年06期 v.33 634-639页 [查看摘要][在线阅读][下载 1461K] [下载次数：546 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘青;宁超;杨捷玲;岳小丁;
目的探讨miR-590-5p与信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的靶向作用关系及其对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)Y-79细胞生长和转移能力的影响。方法临床收集人RB组织样本和癌旁组织样本各20份,RT-PCR检测miR-590-5p和STAT3基因的转录水平,并分析两者的相关性。RT-PCR检测RB细胞株Y-79和SO-RB50及正常视网膜细胞株HREC中miR-590-5p基因的转录水平。荧光素酶报告基因试验检测miR-590-5p和STAT3的相互作用关系。将Y-79细胞分为Y-79、miR-NC、miR-590-5p mimic和mi R-590-5p mimic+STAT3组,转染相应的miRNA及载体,RT-PCR检测mi R-590-5p和STAT3基因转录水平,Western blot检测STAT3、增殖蛋白Ki67、活化半胱天冬酶(cleave caspase-3,cl-caspase-3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)蛋白表达水平,CCK8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果与正常视网膜组织比较,RB组织中mi R-590-5p基因转录水平显著降低,STAT3基因转录水平显著升高(P <0. 01),且miR-590-5p与STAT3基因转录水平呈负相关(r=-0. 883 5,P <0. 001)。与正常视网膜细胞比较,SO-RB50和Y-79细胞miR-590-5p转录水平显著降低(P <0. 01),从中选取miR-590-5p转录水平最低的Y-79细胞进行后续试验。与Y-79组比较,miR-590-5p mimic组mi R-590-5p表达水平显著升高,STAT3基因转录和蛋白表达水平显著降低,细胞增殖水平显著降低,细胞凋亡率显著升高,Ki67、VEGF、MMP-9蛋白表达水平显著降低,cl-caspase-3蛋白表达水平显著升高(P <0. 01);与miR-590-5p mimic组比较,miR-590-5p mimic+STAT3组STAT3蛋白表达水平显著升高,细胞增殖水平显著升高,细胞凋亡率显著降低,Ki67、VEGF、MMP-9蛋白表达水平显著升高,cl-caspase-3蛋白表达水平显著降低(P <0. 01)。与STAT3 WT+miR-NC组比较,STAT3 WT+miR-590-5p mimic组荧光素酶活性显著降低(P <0. 01)。结论 miR-590-5p可通过靶向作用于STAT3,抑制RB Y-79细胞的生长和转移能力。
2020年06期 v.33 640-647页 [查看摘要][在线阅读][下载 1372K] [下载次数：97 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 杨丽华;马宇锋;韩剑星;
目的分析维生素D受体蛋白(vitamin D receptor protein,VDR)的理化性质、分子结构和蛋白的相互作用,及其在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)中的功能及作用机制。方法利用NCBI、ExPASy、Protscale、SignalP 4. 0 Server、TMHMM Server v. 2. 0、PSORTⅡ、SOPMA、Conserved Domain、SWISS-MODEL、NetNGlyc 1. 0 Sever、NetOGlyc 4. 0 Server、Netphos 2. 0 Server、STRING等生物信息学软件对VDR进行结构、性质方面的系统分析。结果 VDR是一种酸性不稳定的亲水性蛋白,无信号肽形成区域,无跨膜结构,广泛定位于细胞核,是一种非分泌型蛋白。VDR的主要二级结构为无规卷曲,是NR-LBD超家族及NR-DBD样超家族的成员之一,可与RXRG、RXRB、EP300等蛋白发生理化相互作用。结论 VDR不仅参与甲状腺激素信号通路、脂肪细胞因子信号通路等信号通路,还参与Th17细胞的分化过程,为研究VDR在OSAHS发生发展过程中的作用提供了参考。
2020年06期 v.33 648-652+657页 [查看摘要][在线阅读][下载 1390K] [下载次数：172 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王秋菊;宋晓玉;张莉;史敏;陈义波;贺巧;胥萍瑶;倪苏娇;吕梦宇;吴睿;赖琴;赵燕珍;
目的分析前列腺癌组织中T-cadherin基因mRNA转录水平,探讨T-cadherin基因通过雄激素受体(androgen receptor,AR)通路抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的作用。方法收集前列腺癌及癌旁相应正常组织各60份,实时荧光定量PCR检测组织中T-cadherin mRNA转录水平;将培养24 h的前列腺癌LNCaP细胞分为腺病毒GFP组、腺病毒GFP-T-cadherin组及空白对照组(不含腺病毒),CCK-8法检测T-cadherin对前列腺癌LNCaP细胞增殖的影响,Western blot法检测过表达T-cadherin后前列腺癌LNCaP细胞中AR及前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)蛋白表达水平,并检测不同组别LNCaP胞浆及胞核中AR蛋白表达水平。结果 T-cadherin基因在癌组织中较癌旁组织mRNA转录水平明显减少(P <0. 01),其转录水平与前列腺癌的分期、格里森评分及分化均有关(P均<0. 05);与空白对照组比较,腺病毒GFP-T-cadherin组能抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖(P <0. 05),而T-cadherin过表达能下调LNCaP细胞中AR及下游靶基因PSA的表达水平(P均<0. 05)。结论前列腺癌组织中T-cadherin基因mRNA转录水平明显减少,其过表达能通过AR通路抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖,本研究为前列腺癌的治疗提供了新的靶点。
2020年06期 v.33 653-657页 [查看摘要][在线阅读][下载 1121K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 詹雪龙;牛春阳;薛琳琳;计红;李士泽;郭景茹;甄莉;
目的高通量测序技术分析冷应激大鼠肝脏基因mRNA差异表达。方法将SPF级大鼠随机分为冷刺激组[(4±0. 05)℃]及常温对照组[(24±0. 05)℃],刺激24 h。采集2组大鼠肝脏组织并提取总RNA,应用Ⅲumina HiSeg平台测序,对筛选的差异表达基因进行基因功能(Gene Ontology,GO)注释及信号通路数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,采用qRT-PCR验证随机筛选的基因mRNA表达水平。结果经测序分析,冷刺激组发掘新基因293个,其中244个有功能注释,差异表达基因98个;经GO分析,差异表达基因显著富集细胞过程、生物调控、代谢过程、细胞组分、细胞器、蛋白质运输等过程;经KEGG分析,大多数差异表达基因注释在原发性免疫缺陷、癌症形成过程、用于IgA生成的肠道免疫网络、细胞因子与细胞因子受体相互作用等通路,在MAPK、PI3K-Akt信号通路和内质网蛋白加工通路中表达量极高,在乙型肝炎和病毒感染通路表达量较低。与常温对照组比较,冷刺激组大鼠肝脏的多配体聚糖4(syndecan 4,Sdc4)及白蛋白(albumin,Alb)基因表达水平上调,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论成功筛选冷应激大鼠肝脏差异表达基因,该类基因很可能参与了机体代谢及损伤修复等过程,为深入研究大鼠冷应激机制积累了数据。
2020年06期 v.33 658-664页 [查看摘要][在线阅读][下载 2506K] [下载次数：369 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 朱传凤;韦钦钦;白慕群;王婉;傅生芳;马超;高雪军;
目的建立人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)微型基因组拯救系统,并鉴定其功能。方法利用包含T7启动子、锤头状核酶、hRSV的前导序列、基因起始信号、非编码区、多克隆位点、基因终止信号、尾随序列、丁肝核酶、T7终止子的基本载体pRSV1和pRSV2,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因构建微型基因组质粒pRSV1-eGFP和微型反基因组质粒pRSV2-eGFP。以pcDNA3. 1(+)为表达载体,与优化后的RSV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、聚合酶大片段(L)和转录延长/终止抑制因子(M2-1)基因序列构建辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L和pcDNA-M2-1。将微型基因组质粒或微型反基因组质粒通过单转染、与RSV共感染或与辅助质粒共转染至表达T7 RNA聚合酶(T7 RNP)的BSR-T7/5细胞,荧光显微镜或流式细胞仪观察eGFP的表达,并鉴定微型基因组的功能及辅助蛋白的生物学活性。结果微型基因组质粒、微型反基因组质粒和4个辅助质粒经双酶切及测序证明构建正确;微型基因组质粒通过先感染后转染或与辅助质粒共转染,观察到eGFP的表达,证实了微型基因组的功能活性;缺乏N、P或L蛋白,检测不到eGFP的表达;缺乏M2-1蛋白,eGFP的表达量降低。结论成功建立了RSV微型基因组拯救系统,并证实了其拯救功能,为利用反向遗传学手段拯救重组RSV,研发RSV减毒活疫苗奠定了基础。
2020年06期 v.33 665-670+675页 [查看摘要][在线阅读][下载 1450K] [下载次数：241 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 邹浩勇;喻剑虹;龚钦;彭焱;
目的验证人免疫球蛋白类制品中IgA残留量的ELISA检测方法,并进行应用。方法用IgA国际标准品建立与ELISA检测试剂盒相匹配的标准曲线,并验证方法的准确性、专属性、精密度及线性范围。分别采用ELISA法、紫外法和免疫比浊法检测4批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品。同时用经验证的ELISA法检测35批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品中的IgA含量。结果加入0. 5、1、2 IU/L标准品的样品平均回收率分别为90. 33%、94. 43%、93. 37%,CV分别为4. 5%、1. 8%、3. 1%;标准品加入100、50、25 mg/L麦芽糖的回收率分别为99. 44%、99. 38%、99. 67%,CV分别为0. 16%、0. 13%、0. 11%;两个时间点6次重复测定结果的CV均<10%,且两个时间点的测定结果差异无统计学意义(P> 0. 05);IgA浓度在0. 5~8 IU/L范围内与A450呈良好的线性关系,回归方程为y=0. 088 7 x2-0. 111 5 x+0. 188,R~2=0. 999 9。与紫外法和免疫比浊法比较,ELISA法检测结果偏低,紫外法最高,3种方法间差异有统计学意义(P <0. 05)。35批静注人免疫球蛋白(pH 4)成品中IgA含量均值为(22. 4±2. 24)IU/mL,CV <10%。结论 ELISA检测方法具有良好的准确性、专属性及精密度,且快速、灵敏,操作简便,可用于人免疫球蛋白类制品中IgA含量的质量监测。
2020年06期 v.33 695-698页 [查看摘要][在线阅读][下载 1281K] [下载次数：363 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李睿;周谡;朱鸿雁;张志超;方静;唐黎明;
目的研究不同来源的T细胞及红细胞在胸腺肽类免疫增强剂活性检验方法中的替代性。方法 T细胞活性测定法-脱E受体法(E-玫瑰花结试验)参照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS1-(X-001)-2002Z进行,采用豚鼠胸腺T细胞作为T细胞来源,兔红细胞作为红细胞来源,并对豚鼠周龄、脱E条件、兔红细胞保存方式进行优化;采用Jurkat细胞作为T细胞来源,绵羊红细胞作为红细胞来源,并对脱E时间、给药浓度、给药时间进行优化。结果豚鼠胸腺T细胞与兔红细胞可形成玫瑰花结,最佳试验条件为:选取4~7周龄豚鼠胸腺T细胞,45℃孵育1 h脱去E受体,用阿氏液保存兔红细胞;Jurkat细胞与绵羊红细胞可形成玫瑰花结,最佳试验条件为:45℃孵育30 min脱去E受体,1 mg/mL给药。结论豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞及Jurkat细胞-绵羊红细胞的组合可形成玫瑰花结,但对样品的反应性不如猪胸腺T细胞-绵羊红细胞的组合。
2020年06期 v.33 699-704页 [查看摘要][在线阅读][下载 1429K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 郭胜苍;俞露;富瑞丽;王莹;刘玉林;张宇;王江林;刘涵;
目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法 rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果 Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95. 40%、95. 90%和99. 19%,宿主蛋白残留量分别为2 500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0. 56和0. 12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24. 5、3. 2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97 300,等电点范围为5. 5~6. 5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。
2020年06期 v.33 705-708+713页 [查看摘要][在线阅读][下载 1493K] [下载次数：740 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]