- 胡波;叶琳;蒋丽明;张鹏艳;施慧敏;谭昌耀;
目的探讨包含前S1、前S2和S抗原的新型重组乙型肝炎疫苗(简称SS1S2疫苗)在小鼠中诱导体液和细胞免疫应答的能力以及在无应答小鼠中的免疫原性。方法以不同剂量(2.0、0.5、0.125、0.03μg)的SS1S2疫苗或商品化单S乙型肝炎疫苗(简称S疫苗)免疫BALB/c小鼠,于免后1、2、4周时采血,采用ELISA法检测两组疫苗单只小鼠血清的S、前S1和前S2抗体。以SS1S2疫苗或单S疫苗于0和3周时免疫BALB/c小鼠,每只5μg,于每次免疫后1周处死一半小鼠,制备脾脏淋巴细胞,采用ELISPOT法检测分泌IFNγ的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)频数。以单S疫苗于0、2、4周时免疫NIH小鼠,于末次免疫后4周采血,测定S抗体,筛选无应答小鼠。将无应答小鼠分为两组,分别用SS1S2疫苗或单S疫苗加强免疫1次,于免后1个月采血,测定S抗体。结果免后1、2周,2.0、0.5、0.125μg的SS1S2疫苗组S抗体阳转率均高于同剂量的单S疫苗组,且能诱导前S1、前S2抗体产生,而单S疫苗组无前S1、前S2抗体产生;免后4周,两组疫苗的抗体阳转率在总体上继续增加,2.0、0.5、0.125μg的SS1S2疫苗组S抗体几何平均滴度(GMT)均高于同剂量的单S疫苗组,且有一定滴度的前S1、前S2抗体,而单S疫苗组无前S1、前S2抗体产生。初免后1、4周,SS1S2疫苗组小鼠IFNγ分泌细胞频数均明显高于单S疫苗组(P<0.05或<0.01)。以0.5μg SS1S2疫苗或单S疫苗对经3剂单S疫苗免疫无应答NIH小鼠进行1次加强免疫后,SS1S2疫苗组小鼠抗体阳转率和GMT均明显高于单S疫苗组(P均<0.01)。结论与商品化单S乙肝疫苗相比,SS1S2疫苗在小鼠中诱导的抗体产生时间较早,抗体阳转率和抗体滴度较高,还能诱导前S1、前S2抗体产生;SS1S2疫苗比单S疫苗诱导了更高水平的特异性CTL应答;在无应答小鼠中能诱导更大比例和更高滴度的保护性抗体产生,表现出更好的免疫原性。
2017年06期 v.30 561-565+570页 [查看摘要][在线阅读][下载 209K] [下载次数：160 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：987 ] - 闫江泓;于鹏程;陶晓燕;刘淑清;吴未辰;卢学新;李淑英;朱武洋;
目的探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)对狂犬病疫苗(rabies vaccine,RV)免疫效果的影响。方法以市售狂犬病疫苗为抗原,分别以低、中、高剂量的CpG ODN(1.25、5、20μg/剂)及其与氢氧化铝[(Al(OH)_3]联合的复合物作为疫苗佐剂,按Essen程序经腿部肌肉免疫BALB/c小鼠。免疫前2 d及首次免疫后分别于第6、8、10、14、35和42天采血,分离血清,通过快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测血清中抗狂犬病病毒中和抗体效价;并经ELISPOT法分析首次免疫第6和14天小鼠脾细胞分泌IFNγ的情况。结果低、中剂量的CpG ODN及其与Al(OH)_3联合使用均可使小鼠在首次免疫后第8天产生具有保护水平的中和抗体,第10天阳转率均达100%;在首次免疫后第35及42天,小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体水平均明显升高(P<0.05);在首次免疫后第6及14天,低、中剂量的CpG ODN可明显提高小鼠脾细胞的IFNγ分泌水平(P<0.05)。结论 CpG ODN对RV具有免疫增效作用,可能成为一种新型的RV佐剂。
2017年06期 v.30 566-570页 [查看摘要][在线阅读][下载 247K] [下载次数：285 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：966 ]
- 李向茸;令瑛;徐雷;包晓婧;马玉梅;车敏娜;张海霞;冯若飞;
目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。
2017年06期 v.30 571-576页 [查看摘要][在线阅读][下载 372K] [下载次数：344 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1234 ] - 张培彪;张苏;孙颖;刘忠;
目的对毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性进行分析。方法应用疏水层析和C18反相制备,对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、质谱相对分子质量分析,并进行C-末端和N-末端测序。结果 SDS-PAGE测定为单一条带,SEC-HPLC测定为单一峰,但RP-HPLC检测结果出现2个峰;峰2相对分子质量为5 959,是正常的胰岛素前体,峰1为两种混合物,相对分子质量分别为5 716和5 816,可能是缺少了1~2个氨基酸产物;N-末端分别缺少了1个氨基酸(Phe)和2个氨基酸(Phe-Val),C-末端未发生降解。结论利用毕赤酵母得到的人胰岛素前体存在不均一现象,为胰岛素制备提供了新思路。
2017年06期 v.30 577-581页 [查看摘要][在线阅读][下载 278K] [下载次数：131 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1108 ] - 何秀贞;晏永波;诸梦露;林绍强;
目的构建人转录因子T-bet基因与乙肝病毒表面抗原大蛋白全长基因(hepatitis B virus surface antigen large protein,HBV-L)的共表达载体,并检测其在体外的表达。方法利用PCR及基因重组技术,以人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的cDNA为模板,扩增获得人T-bet全长基因,以含有HBV-L的质粒pcDNA3.1-HBV-L为模板,扩增获得HBV-L基因,将上述2个基因克隆至真核表达质粒p IRES中,获得共表达质粒p IRES-T-bet-HBV-L。将该质粒转染293T细胞,经RT-PCR、ELISA和细胞免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达。结果限制性酶谱分析及测序证实重组质粒p IRES-T-bet-HBV-L构建成功;该质粒在体外转染293T细胞后,可表达T-bet与HBV-L两者的mRNA;细胞免疫荧光试验和ELISA检测结果证实,该质粒转染293T细胞后可表达T-bet和HBV-L蛋白。结论成功构建了共表达质粒pIRES-T-bet-HBV-L,该质粒能在293T细胞中表达。
2017年06期 v.30 582-586页 [查看摘要][在线阅读][下载 259K] [下载次数：74 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：976 ] - 李芬;孙大庆;张丽萍;
目的克隆Lactobacillus plantarum LY-78芳香族氨基酸转氨酶基因arat,并对其基因序列进行生物信息学分析。方法利用PCR技术克隆得到芳香族氨基酸转氨酶基因arat的完整序列,测序后运用生物信息学软件预测arat基因对应蛋白的理化性质和结构特征。结果克隆得到了Lactobacillus plantarum LY-78的arat基因,分别命名为arat1和arat2。arat1基因全长为1 188 bp,编码395个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 888.9,pI 5.23;arat2基因全长为1 173 bp,编码390个氨基酸,蛋白相对分子质量为43 042.6,pI 5.64;两者均为亲水、热稳定及非分泌型蛋白,具有高度保守性,均属于天冬氨酸转氨酶家族。结论通过基因克隆技术获得了2个arat基因完整序列,为今后Lactobacillus plantarum LY-78 arat基因改造及PLA合成提供了理论支持。
2017年06期 v.30 587-591+595页 [查看摘要][在线阅读][下载 377K] [下载次数：221 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：922 ] - 何云松;文崇艳;麻广;邹蔚然;刘亚宇;李立;刘晔;
目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。
2017年06期 v.30 592-595页 [查看摘要][在线阅读][下载 157K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：998 ] - 刘承波;宿凌云;邹莉;杨琳娜;董薇;马倩;闫雪兰;冯云;
目的了解云南大理某农村猪群中星状病毒(astrovirus,AstV)感染情况,为AstV的防控提供理论依据。方法利用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nested PCR)技术,对云南大理某农村采集的42份猪粪便样品进行PAstV799 bp基因部分片段扩增、克隆,并测序;利用NCBI BLAST进行数据库比对,Mega 4.1软件进行序列同源性比较和系统进化树构建。结果 Trizol试剂提取42份猪粪便样品上清总RNA,经RT-nested PCR扩增,5份样品可见799 bp的目的基因片段,阳性率为11.90%;PAstV 799 bp片段同源性分析显示,5个毒株与PAstV-1、2、3、4和5的同源性为46.3%~87.9%,与PAstV-4的同源性最高,为75.5%~87.9%;PAstV 799 bp片段的系统进化分析显示,分离的毒株属于PAstV-4,同源性为80.0%~99.5%。结论云南省PAstV-4流行病学调查将有利于中国AstV的预防及治疗。
2017年06期 v.30 596-599+606页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K] [下载次数：176 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：923 ] - 寇芳;康丽君;沈蒙;宁冬雪;夏甜天;王维浩;曹龙奎;
目的探讨自然发酵筛选的优势菌种对小米粉物化特性的影响,为分析自然发酵小米粉的品质及开发小米发酵新途径提供参考。方法按照小米与水1∶1.2 g/ml的比例加入蒸馏水,30℃下自然发酵96 h后,从发酵液中筛选出优势菌种(乳酸菌和酵母菌),扩大培养后,分别在最适温度(乳酸菌37℃,酵母菌28℃)下培养96 h进行发酵,并制备发酵小米粉。扫描电镜观察不同发酵小米粉的颗粒特性;X-射线粉末衍射仪测定其结晶度;RVA4500型快速黏度分析仪测定其黏度;TA.XT Express质构仪测定其淀粉凝胶的质构特性;并利用DSC1型差示扫描量热仪分析其热特性。结果 3种发酵所得小米粉均有明显的淀粉颗粒,而小米原粉则无,且乳酸菌、酵母菌发酵小米淀粉的受损程度高于自然发酵;发酵未使小米淀粉的晶型改变,依然为A型,但乳酸菌、酵母菌发酵小米粉的结晶度较自然发酵增加了3.04%和1.58%;发酵96 h时,乳酸菌、酵母菌发酵的热焓值分别较自然发酵上升2.32和1.27 J/g,峰值黏度降低179和180 m Pa·s,衰减值下降102和349 mPa·s,回生值下降229和50 mPa·s;乳酸菌、酵母菌发酵小米粉的凝胶硬度较自然发酵分别降低34.95和28.45 g,胶着性分别下降25.75和33.203 g。结论自然发酵中乳酸菌、酵母菌对小米粉品质起主要作用。
2017年06期 v.30 600-606页 [查看摘要][在线阅读][下载 365K] [下载次数：303 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：868 ] - 常海平;杨彩荣;郑健;
目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株。方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒)。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因m RNA转录及蛋白的表达水平。结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功。经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株。与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因m RNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。
2017年06期 v.30 607-612页 [查看摘要][在线阅读][下载 386K] [下载次数：205 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：1112 ] - 钱冠华;董晓静;于廷和;段昌柱;
目的观察NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法取正常妊娠妇女人工流产绒毛组织(8~10周),按常规分离方法获得滋养细胞,进行原代培养。通过上/下调NIRF在滋养细胞中的表达后,采用qRT-PCR法检测p53基因mRNA的转录水平;Western blot法检测p53蛋白的表达水平;MTT法检测滋养细胞的增殖能力;Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况。结果与未转染组比较,NIRF上/下调后,p53基因m RNA转录水平差异无统计学意义(P>0.05);NIRF上调,p53蛋白表达水平明显下降(P<0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);NIRF下调,p53蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),凋亡率明显上升(P<0.05)。结论 NIRF在蛋白水平上抑制了p53的表达,促进了滋养细胞的增殖。
2017年06期 v.30 613-617+622页 [查看摘要][在线阅读][下载 361K] [下载次数：82 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：893 ]
- 庞立丽;白爱英;张顺先;章青;李丹地;袁越;王宏;孙晓曼;孔翔羽;段招军;
目的优化不同长度聚肌苷酸胞苷酸[polyinosinic acid:polycytidylic acid,poly(I∶C)]在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活Ⅰ型干扰素(IFNβ)荧光素酶报告基因系统的实验条件。方法将质粒IFN-β-luc分别转染HEK293T及BEAS-2B细胞后,HEK293T细胞转染不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5和2.0μg/孔)的高分子量(HMW)poly(I∶C)和低分子量(LMW)poly(I∶C),检测其对HEK293T细胞中IFNβ启动子激活的影响;BEAS-2B细胞直接加入不同浓度(0.1、1.0、10.0、20.0和50.0μg/孔)及转染不同浓度(同HEK293T细胞)的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C),检测其对BEAS-2B细胞中IFNβ启动子激活的影响。结果 poly(I∶C)转染HEK293T细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:0.5μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)转染24 h。poly(I∶C)直接加入BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:50μg/孔的HMW poly(I∶C)和LMW poly(I∶C)作用6 h;poly(I∶C)转染BEAS-2B细胞激活IFNβ启动子的最佳实验条件为:0.25μg/孔的HMW poly(I∶C)转染12 h,0.5μg/孔的LMW poly(I∶C)转染12 h。结论成功优化了poly(I∶C)在HEK293T和BEAS-2B细胞中激活IFNβ启动子的实验条件,为poly(I∶C)激活免疫反应机制的研究提供了实验依据。
2017年06期 v.30 640-644页 [查看摘要][在线阅读][下载 260K] [下载次数：324 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：971 ] - 李亚南;朱向国;毛琦琦;陈苏京;赵丹;王珊珊;徐颖华;叶强;李茂光;
目的建立AC群脑膜炎球菌与b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)联合疫苗(Men AC-Hib)多糖含量免疫速率比浊检测方法,并进行验证。方法采用免疫速率比浊法测定联合疫苗中A群、C群脑膜炎球菌及Hib多糖含量,绘制不同多糖抗原含量的标准曲线,并对方法的检测低限、精密度、准确度和特异性进行验证。结果 3种不同多糖抗原浓度在2~8μg/ml之间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.98;建立的方法检测A群、C群脑膜炎球菌和Hib多糖的检测低限分别为0.847、0.043和0.507μg/ml;检测各组分多糖抗原含量的批内和批间变异系数均小于5%,平均回收率在88.30~104.40%之间;各组分特异性多糖抗体仅与各自多糖抗原反应,且各组分多糖抗原共同存在时无相互干扰。结论成功建立了准确、特异的AC群脑膜炎球菌与Hib联合疫苗的多糖含量检测方法。
2017年06期 v.30 645-648页 [查看摘要][在线阅读][下载 167K] [下载次数：222 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1000 ] - 芦慧颖;杜文敬;刘春香;孟庆雪;付寅生;石佳宁;张婷婷;张怡;
目的采用二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。方法将传统组织块贴壁法弃掉的脐带组织块转移至新的培养瓶中进行二次贴壁,分离hUC-MSCs,并用无血清培养体系连续传代,镜下观察细胞形态;分别检测不同代次细胞的增殖能力、细胞周期、免疫表型、多向分化能力。结果二次贴壁法分离的hUC-MSCs在第4天即出现细胞克隆,第8天汇合度可达70%,经过二次贴壁法,1根20 cm的脐带组织共获得P3间充质干细胞(MSCs)总数为1×10~9个。二次贴壁分离的细胞增殖能力旺盛,与一次贴壁获得的干细胞同代次平均倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)。传统贴壁法与二次贴壁分离的细胞均表达超过98%的CD73、CD90、CD105和低于2%的CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR,且该细胞具有分化为成骨、成软骨和成脂能力。结论经无动物源培养体系体外扩增的二次贴壁分离方法可以获得大量具有MSCs生物学特性的hUC-MSCs,为其规模化临床应用奠定了基础。
2017年06期 v.30 649-654页 [查看摘要][在线阅读][下载 550K] [下载次数：314 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：927 ] - 王卜勇;陈道芳;张行;周伟伟;方斌奇;章文彬;杨文韬;李强;胡利平;
目的在生物反应器中用微载体连续灌流培养Vero细胞,制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗。方法在50 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的DMEM培养基,接种Vero细胞,当细胞密度约达5×10~6个/ml时,感染肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)毒种,接毒后72 h开始收获,连续收获17 d,收获的病毒原液经浓缩、灭活、Sepharose 4FF凝胶层析纯化后制备疫苗,检测病毒滴度、抗原含量及残余牛血清白蛋白、DNA、宿主蛋白含量,并接种新西兰家兔,检测疫苗效力。结果确定最佳Vero细胞接种浓度为1×10~5个/ml,病毒最佳MOI为0.015。利用优化后的培养条件收获的病毒滴度在6.5~8.0 log CCID_(50)/ml,且各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论用生物反应器微载体灌流培养制备Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗的小试工艺可行。
2017年06期 v.30 655-657+663页 [查看摘要][在线阅读][下载 174K] [下载次数：228 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：950 ] - 张超凤;严美婷;杜霞;陈卫平;张凤英;
目的响应面法优化纳豆激酶液态发酵条件。方法以纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis Natto)为出发菌株,液态发酵纳豆激酶。在单因素试验确定接种量、温度、初始pH及发酵时间对纳豆激酶活力产生影响的基础上,采用BoxBehnken软件进行响应面优化。结果最终确定纳豆激酶液态发酵的最佳条件为:接种量3%,温度40℃,pH 7.0,发酵时间84 h。在该条件下液态发酵生产纳豆激酶的活力可达749.41 U/ml,与模型预测的酶活力(752.35 U/ml)的相对误差为0.39%。结论成功优化了纳豆激酶液态发酵条件,为纳豆激酶的产业化生产奠定了基础。
2017年06期 v.30 658-663页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K] [下载次数：338 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：923 ]