- 贾恩朝;夏文娇;路臣桂;张会勇;朱武凌;
目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。
2017年04期 v.30 346-350页 [查看摘要][在线阅读][下载 260K] [下载次数：181 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 黎奎;孙鹏艳;姚宇峰;刘存宝;黄惟巍;王世杰;褚晓杰;白红妹;杨旭;孙文佳;马雁冰;
目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。
2017年04期 v.30 351-356页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K] [下载次数：238 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 钱锋;刘晓;李梦梦;陈勇;蒋琳;徐沪济;
目的检测恶性疟原虫表面蛋白25(Plasmodium falciparum surface protein 25,Pfs25)与鼠伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白(phase 1 flagellin of Salmonella enterica serovar Typhimurium,FliC)的融合蛋白FliC-Pfs25,在硫氧还蛋白还原酶基因(thioredoxin reductase gene,trxB)和谷胱甘肽还原酶基因(glutathione reductase gene,gor)双突变大肠埃希菌Origami2(DE3)中的表达。方法将含有Pfs25和FliC基因的重组质粒pET28a(+)-fliC-pfs25转化Origami2(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白FliC-Pfs25,破菌上清经Ni-Sepharose纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的融合蛋白配制成不同的疫苗制剂免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠免疫血清中抗Pfs25抗体水平。结果融合蛋白FliC-Pfs25在Origami2(DE3)中以可溶性形式表达;纯化的融合蛋白可被两个抗Pfs25的单抗mAb 1A6和mAb 4D10识别;融合蛋白与铝佐剂结合在小鼠中激发出抗Pfs25的抗体应答,但Origami2(DE3)表达的FliCPfs25与抗Pfs25单抗的反应以及在小鼠中激发抗Pfs25抗体的能力,均弱于大肠埃希菌BL21(DE3)表达的FliCPfs25。结论融合蛋白FliC-Pfs25在大肠埃希菌Origami2(DE3)中成功获得表达,但trxB和gor两个基因的突变未显示出能够提高该融合蛋白在大肠埃希菌中的表达量。
2017年04期 v.30 357-361页 [查看摘要][在线阅读][下载 252K] [下载次数：100 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨佳佳;姜黎明;罗佳;叶超;文送娇;孙强明;
目的比较感染登革病毒(dengue virus,DV)的C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞的CPE情况,并进行病毒检测。方法将分离自云南西双版纳的Ⅲ型DV中国株D13053和广东省疾病预防控制中心惠赠的Ⅱ型中国株D10156,以5 MOI感染C6/36、Vero、BHK-21和THP-1细胞,同时将Vero和C6/36细胞来源的DV,分别以5 MOI感染C6/36细胞,连续观察CPE至第10天,并利用DV通用引物,RT-PCR法鉴定细胞培养上清中的病毒。结果C6/36细胞对DV最敏感并有明显的病变,细胞几乎100%聚集、破碎并呈网格状;Vero、BHK-21细胞至第5天出现脱落、破碎和悬浮等病变,对DV有一定的敏感性;THP-1细胞至第10天未出现CPE。PCR核酸检测发现,感染DV的C6/36、THP-1、BHK和Vero细胞培养上清中可检测到DV,而Vero细胞来源DV感染的C6/36细胞未检测到DV。结论 DV对不同细胞系的感染能力和感染DV后CPE的表现形式存在较大差异。
2017年04期 v.30 362-365+371页 [查看摘要][在线阅读][下载 272K] [下载次数：614 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 曾仁勇;刘园园;袁靖;陈云华;杨刚;曹海军;李长清;
目的探讨β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)起始聚合浓度及PBS体系中添加SDS对Aβ寡聚体生成的影响。方法 Aβ_(40)、Aβ_(42)经六氟异丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol,HFIP)单体化处理后,分别溶于PBS及添加0.05%SDS的PBS中,Aβ样本250、125、62.5、31.2、15.6及7.8μmol/L梯度聚合,37℃恒温,100 r/min聚合72 h后,进行SDS-PAGE分析。结果 Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合的寡聚体生成量随着Aβ起始浓度的升高而增加。Aβ_(40)在无SDS制备条件下能生成大量二聚体、三聚体及少量十二聚体;SDS制备条件下生成二聚体及少量十二聚体。无SDS制备条件250、125及62.5μmol/L浓度的Aβ_(42)能生成三聚体及中、高相对分子质量的寡聚体弥散带;SDS制备条件250、125、62.5μmol/L浓度的Aβ_(42)可生成三聚体及中等相对分子质量的寡聚体,31.2μmol/L浓度的Aβ_(42)可生成低、中、高相对分子质量的寡聚体。结论适合的起始聚合浓度有利于Aβ_(40)、Aβ_(42)寡聚体的生成;PBS中添加0.05%SDS有利于生成稳定的Aβ_(42)寡聚体,但不利于Aβ_(40)寡聚体的生成。
2017年04期 v.30 366-371页 [查看摘要][在线阅读][下载 330K] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 吴丽娟;赵芳;刘光万;曲洪媛;杨旭霞;廖囡囡;陈丽;杨光;吴昌琳;
目的分析一种siRNA药物载体薄膜在溶液中的稳定性,并评价其基因沉默效应。方法利用层层自组装(layer-by-layer self-assembly,LBL)技术制备壳聚糖(chitosan,CHS)-透明质酸(hyaluronic acid,HA)-siRNA多层薄膜。通过UV-vis吸光度法对siRNA在薄膜上的生长过程以及在不同缓释液中的稳定性分别进行验证。结合荧光图像和流式细胞术,采用直接与细胞接触的方式检测该siRNA载体薄膜的HEK293T细胞转染效应。结果 CHS-HA-siRNA多层薄膜在260 nm处有很强的吸收峰,且随着含siRNA的组装层数的增加,在260 nm的吸光度值越大。该siRNA载体薄膜在1 mol/L NaCl溶液中释放效果最好,在pH 7.4的PBS缓冲液中次之,在纯水中稳定性最好。过低或过高的盐离子浓度对促进薄膜的崩解无优势。阳性对照组7-eGFP-siRNA和2-eGFP-siRNA具有较好的沉默绿色荧光蛋白基因的效应;在细胞培养2 d后的转染试验中,阳性对照组7-eGFP-siRNA较2-eGFP-siRNA组显示出更强的基因沉默效应。结论成功构建了一种非病毒siRNA递送载体系统,为未来实现siRNA局部给药开辟了一条可行的途径。
2017年04期 v.30 372-376+380页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K] [下载次数：131 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 喻备;黄媛;胡海峰;易炜;王云汉;陈林;杨进;
目的构建真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,并在HEK 293-6E细胞中进行表达。方法合成融合基因CTP-PTEN,定向克隆至真核表达载体pTT5中,构建重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,进行双酶切及测序鉴定。在Lipofectamine 2000的介导下,将鉴定正确的重组表达质粒转染至HEK 293-6E细胞,Western blot法检测细胞中融合蛋白CTP-PTEN的表达。结果经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒pTT5-CTPPTEN构建正确。转染48 h后,HEK 293-6E细胞中可见相对分子质量约49 700的CTP-PTEN融合蛋白条带。结论成功构建了重组质粒pTT5-CTP-PTEN,并于HEK 293-6E细胞中表达了CTP-PTEN融合蛋白。
2017年04期 v.30 377-380页 [查看摘要][在线阅读][下载 193K] [下载次数：250 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 薛俊英;付加芳;韩金祥;王世立;
目的探讨人骨肉瘤细胞U2-OS表达重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)的可行性。方法将hBMP-7成熟肽基因片段克隆至载体pcDNA3.1上,构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7。利用Lipofectamine 2000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达。结果真核组表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7经NdeⅠ和EcoRⅤ双酶切及测序鉴定证明构建正确。pcDNA3.1-rhBMP-7质粒转染的U2-OS细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达水平均明显高于pcDNA3.1载体转染的细胞(P<0.05)。结论成功构建了hBMP-7基因的重组表达质粒,并在U2-OS细胞中成功表达,为进一步研究hBMP-7的制备方法和建立新的表达系统奠定了基础。
2017年04期 v.30 381-385页 [查看摘要][在线阅读][下载 240K] [下载次数：61 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 董艳国;仇梓冰;
目的探讨二十八烷醇对小鼠体力疲劳的缓解作用。方法将小鼠分成对照组、二十八烷醇低剂量组和二十八烷醇高剂量组,用乳化的二十八烷醇分别以10和20 mg/(kg·d)的剂量饲育低剂量组和高剂量组小鼠,对照组供给自来水,实验期为4周。检测二十八烷醇对小鼠运动耐力、血乳酸(lactic acid,LAC)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、糖原含量及血乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力的影响。结果二十八烷醇能提高小鼠的运动耐力;明显降低运动一段时间后的LAC和BUN含量(P<0.05),提高LDH的活力(P<0.05),显著增加肌糖原和肝糖原的储备量(P<0.05);雌雄小鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论二十八烷醇具有明显的缓解实验小鼠体力疲劳的作用,为富含二十八烷醇抗疲劳功能性运动员食品的开发利用提供了实验依据。
2017年04期 v.30 386-389+394页 [查看摘要][在线阅读][下载 172K] [下载次数：315 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 刘飞;王超;王振瑶;刘婷婷;李玉芹;
目的探讨植物激素诱导对小球藻Chlorella vulgaris细胞生物量、油脂含量及内生激素浓度的影响规律。方法分别以天然植物源脱落酸(abscisic acid,ABA)、工业合成萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)和二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)诱导培养小球藻Chlorella vulgaris细胞,细胞干重法检测藻细胞生物量及油脂含量,气相色谱-质谱(GC-MS)分析脂肪酸组成,高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)测定内生激素浓度。结果 NAA诱导对藻细胞生长和脂质合成积累表现出显著的促进效应,其最大油脂产率为418.6 mg/(L·d),分别为2,4-D和ABA诱导藻细胞的1.48和1.83倍;NAA诱导有效调整了小球藻胞内饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸比例,使其组成和含量更易于制备高质量生物柴油;NAA作为激素合成前体参与内生激素(吲哚乙酸、茉莉酸和水杨酸)生物合成,促进内生激素水平升高,而提高浓度的内生激素可能通过一定的信号途径刺激藻细胞生长和合成脂质。结论植物类激素NAA可作为植物源激素替代物用于低成本微藻油脂生产,为制备经济可行的、高质量生物柴油提供了新的途径。
2017年04期 v.30 390-394页 [查看摘要][在线阅读][下载 231K] [下载次数：463 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ]
- 邱泊宁;王翀;赵永坤;胡星星;王化磊;曹增国;盖微微;崔健男;闫飞虎;杨松涛;夏咸柱;
目的采用层析技术制备高纯度的马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrom coronavirus,MERS-CoV)F(ab’)_2。方法以MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,采用亲和层析技术提取血清IgG,经胃蛋白酶酶切后,通过阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分别对F(ab’)_2进行纯化;以MERS假病毒检测所制备的IgG与F(ab’)_2中和活性。结果凝胶过滤层析实现了F(ab’)_2的高纯度分离,最终制备的F(ab’)_2收率约70%,纯度为93%以上,具有良好的中和活性,其半数抑制浓度(IC_(50))为5.13μg/ml。结论制备了高纯度马抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2,为人用抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2生产工艺的建立奠定了基础。
2017年04期 v.30 417-423+428页 [查看摘要][在线阅读][下载 400K] [下载次数：223 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 王利锋;袁芳;何红秋;陈锐;
目的将复合干扰素(consensus interferon,cIFN)76位点丙氨酸(Ala)突变为半胱氨酸(Cys),以期获得一种高效和可供聚乙二醇马来酰亚胺(PEG-MAL)定点修饰的IFN突变体分子。方法采用同源序列对比、空间结构模拟并结合IFNα与受体结合的特点设计突变位点。通过基因工程方法获得cIFN_(m76)工程菌,IPTG诱导表达,所得包涵体经变复性、DEAE阴离子及CM阳离子两步交换层析纯化后,采用SDS-PAGE和高效液相色谱法(HPLC)检测cIFN_(m76)的纯度;细胞病变抑制法检测其体外抗病毒活性;REFLEX~(TM)Ⅲ基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)测定其相对分子质量;SDS-PAGE分析cIFN_(m76)与PEG-MAL的交联反应;并进行N-末端、C-末端序列测定及紫外光谱扫描。结果 cIFN_(m76)以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯度大于95%,比活性约为1.08×10~8IU/mg,N-末端、C-末端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量经MALDI-TOF-MS测定为19 500,紫外特征吸收波长为280 nm,与PEG-MAL成功交联。结论成功获得一种高效和可供PEG-MAL定点修饰的cIFN_(m76),解决了现有PEG定点修饰技术存在的问题。
2017年04期 v.30 424-428页 [查看摘要][在线阅读][下载 259K] [下载次数：191 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 钟琦;章楚光;顾肖萍;刘维薇;
目的评价并分析环介导等温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测尖锐湿疣患者(Condyloma acuminatum,CA)疣体组织中低危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的分型情况。方法针对CA常见HPV的7种亚型(包括HPV6、11、16、18、42、43、44型)基因的保守序列L1,设计LAMP引物。收集40份上海市皮肤病医院2015年6月至2016年6月病理确诊为CA患者的疣体组织石蜡包埋块,提取DNA,以其为模板进行LAMP,分别使用羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)颜色指示剂和琼脂糖核酸电泳同时判定扩增结果,并与PCR流式荧光杂交法的检测结果进行比较。结果 40份样本中共测得HPV阳性30份,其中HPV6型18份,11型7份、16型1份,42型1份,43型2份,44型2份,有1份为43及44型混合阳性,未测得18型阳性样本。LAMP法与PCR流式荧光杂交法总体符合率为95%(38/40)。结论 LAMP法可用于常见HPV低危型别的检测,且操作简便、准确。
2017年04期 v.30 429-432页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K] [下载次数：90 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]