- 李铮;贾媛;迟祥;宋昊;唐剑光;徐军;陈子杨;张健锋;孟多佳;韩顺子;于爱东;迟春萍;时成波;刘照惠;
目的分析重组戊型肝炎疫苗P179抗原蛋白颗粒及二聚体在不同条件下的稳定性,为该抗原的纯化工艺及原液储存条件提供参考。方法将重组戊型肝炎疫苗原液置不同温度、不同p H、高盐浓度、高盐低p H条件下及低温长期储存后,通过透射电镜观察P179抗原蛋白颗粒状态,SDS-PAGE分析二聚体含量。结果 HEV抗原在不同温度、不同p H、高盐浓度、高盐低p H条件下,及低温储存不同时间,P179抗原蛋白颗粒维持在20 nm左右,二聚体含量不低于80%;P179抗原低温储存24个月,其蛋白颗粒及二聚体含量均未发生明显改变。结论重组戊型肝炎疫苗P179抗原蛋白颗粒及二聚体稳定性较好。
2016年12期 v.29 1233-1237页 [查看摘要][在线阅读][下载 484K] [下载次数：281 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张安宁;于立芹;陈晓梅;史晓莉;李瓯;李磊;张建军;付永其;
目的观察中试阶段制备的麻腮风水痘(measles,mumps,rubella and varicella,MMRV)联合减毒活疫苗的稳定性。方法将检定合格的3批中试阶段制备的MMRV联合减毒活疫苗分别置-20℃、2~8℃、室温(25℃)和37℃,定期对其病毒滴度进行检测;在0和18月进行鉴别试验、物理检查、水分检测、无菌检查、异常毒性检查、牛血清白蛋白残留量检测、抗生素残留量检测。结果 -20℃放置18个月,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于4.55 lg CCID_(50)/ml、5.05 lg CCID_(50)/ml、3.80 lg CCID_(50)/ml和4.65 lg PFU/ml;2~8℃放置18个月,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于4.05 lg CCID_(50)/ml、4.93 lg CCID_(50)/ml、3.80 lg CCID_(50)/ml和4.32 lg PFU/ml;25℃放置6周,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于3.80 lg CCID_(50)/ml、4.43 lg CCID_(50)/ml、3.93 lg CCID_(50)/ml和3.87 lg PFU/ml;37℃放置4周,MMRV联合减毒活疫苗中麻疹、腮腺炎、风疹及水痘病毒滴度分别不低于3.80 lg CCID_(50)/ml、4.43 lg CCID_(50)/ml、3.93 lg CCID_(50)/ml和3.84 lg PFU/ml。其他各项指标检测结果均符合制造及检定规程要求。结论冻干MMRV联合减毒活疫苗稳定性良好。
2016年12期 v.29 1238-1241+1245页 [查看摘要][在线阅读][下载 155K] [下载次数：467 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 陈立新;苗丽;段叶叶;顾莉莉;朱琨莹;刘岩;柴博雅;闫峰;闫昆明;郭世杰;
目的观察冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在豚鼠体内主动过敏反应情况。方法将18只雌性豚鼠随机分为3组:阴性对照组(给予0.9%氯化钠注射液,致敏剂量为0.5 ml/只,激发剂量为1 ml/只)、阳性对照组[给予人血白蛋白,致敏剂量为20 mg/(0.5 ml·只),激发剂量为40 mg/(1 ml·只)]、供试品组[给予冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞),致敏剂量为1剂/(0.5 ml·只),激发剂量为2剂/(1 ml·只)],每组6只。致敏试验均经豚鼠后肢肌肉多点注射,隔日免疫1次,共免疫3次;末次致敏后14 d进行激发试验,均经豚鼠足部静脉注射给药,观察各组豚鼠的一般临床症状、体重及全身过敏反应症状。结果致敏期间,所有动物均未见异常表现。试验期间,各组豚鼠体重均呈增长趋势。静脉激发后,阴性对照组豚鼠未见过敏反应症状,过敏反应呈阴性;阳性对照组过敏反应呈阳性至极强阳性;供试品组动物过敏反应呈弱阳性至阳性。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)安全性良好,为其临床使用提供了实验依据。
2016年12期 v.29 1242-1245页 [查看摘要][在线阅读][下载 134K] [下载次数：302 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 于立芹;张安宁;李淑云;刘晓琳;史晓莉;李瓯;张建军;陈晓梅;
目的检测麻腮风水痘(measles,mumps,rubella and varicella,MMRV)联合减毒活疫苗病毒滴定中混合血清对异种病毒的干扰作用。方法滴定MMRV联合减毒活疫苗各病毒成分时,根据各种抗病毒血清的使用浓度,通过不同滴度水平的异种病毒,采用96孔微量版滴定法(麻疹、腮腺炎、风疹病毒)和改良蚀斑法(水痘病毒)检测混合抗血清对其滴度的影响。结果 1∶320抗腮腺炎病毒血清、1∶40抗风疹病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的麻疹病毒无干扰作用;1∶320抗麻疹病毒血清、1∶40抗风疹病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的腮腺炎病毒无干扰作用;1∶320抗麻疹病毒血清、1∶320抗腮腺炎病毒血清和1∶128抗水痘病毒血清的混合血清对不同滴度的风疹病毒无干扰作用;1∶80抗麻疹病毒血清、1∶40抗腮腺炎病毒血清和1∶40抗风疹病毒血清的混合血清对不同滴度的水痘病毒无干扰作用。结论在MMRV联合减毒活疫苗病毒滴定中,混合抗血清对异种病毒无干扰作用。
2016年12期 v.29 1246-1248+1254页 [查看摘要][在线阅读][下载 128K] [下载次数：336 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 周欢;黄元元;肖全斌;李强;曹方;
<正>目前已有部分冻干疫苗使用无明胶、无人血白蛋白保护剂,如水痘疫苗、甲型肝炎疫苗等,而现行的冻干腮腺炎减毒活疫苗仍以明胶和人血白蛋白作为保护剂,因此,有必要开发一种无明胶和人血白蛋白的保护剂配方。本文对3种不同保护剂配方的冻干腮腺炎减毒活疫苗的质量进行了比较,现将结果报道如下。
2016年12期 v.29 1249页 [查看摘要][在线阅读][下载 30K] [下载次数：474 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]
- 王卫芳;刘明远;吴广谋;吴秀萍;
目的原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法克隆LTD基因片段,插入p ET-28a载体,构建重组原核表达质粒p ET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21(Rossetta),经IPTG诱导表达。融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价。结果构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别。血清抗体效价可达1∶6 400。结论成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。
2016年12期 v.29 1250-1254页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] [下载次数：138 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 赵红丽;刘智慧;李婷婷;黄晓娜;初佳芮;陶冬;张楠;柏丛;霍琦;刘辉;
目的对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)在Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞中的复制动力学进行分析。方法将BPIV3分别接种至Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE)情况;采用直接免疫荧光抗体法检测3种细胞盲传3代后BPIV3的增殖情况;将病毒滴度为1.0×104TCID50/ml的BPIV3分别接种至MDBK和Vero-E6单层细胞中,培养7 d,逐日测定各细胞中的病毒滴度。结果BPIV3在MDBK细胞中盲传1代即可观察到明显的CPE;在Vero-E6细胞中盲传2、3代可见CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未见CPE。在MDBK细胞中盲传3代可检测到较强荧光信号;在Vero-E6细胞中盲传3代荧光强度较弱;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到荧光信号。BPIV3在MDBK和Vero-E6细胞中分别于培养第5和6天时病毒滴度达峰值,分别为1.2×1010和1.0×105 TCID50/ml。结论 BPIV3在MDBK细胞中的复制动力强于Vero-E6细胞,最适用于培养该病毒,MRC-5细胞不适用于培养BPIV3。
2016年12期 v.29 1255-1257+1261页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 孙园园;金捷萍;毛淑丹;杨青;明宗杨;李哲;潘静;张宁;
目的探讨白介素-17(interleukin-17,IL-17)对骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖和凋亡的影响及骨髓瘤细胞株IL-17R的表达。方法体外培养RPMI8226细胞,取对数生长期的细胞,分别加入浓度为25、50、100、200、500 ng/ml的rh IL-17(另设不加rh IL-17的对照组),共同培养72 h后,采用MTT法检测IL-17对RPMI8226细胞增殖的影响;TUNEL法检测IL-17对RPMI8226细胞凋亡的影响。将BALB/c雌性小鼠随机分为试验组和对照组,分别经腹部皮下注射含100 ng/ml IL-17和不含IL-17的RPMI8226细胞(5×106个),观察肿瘤生长情况。应用流式细胞术检测RPMI8226细胞IL-17R的表达。结果不同浓度的IL-17与对照组相比,均可促进RPMI8226细胞的增殖(P﹤0.05),抑制细胞凋亡(P﹤0.05)。经IL-17处理的RPMI8226细胞荷瘤小鼠与对照组相比,成瘤时间缩短(P﹤0.05),肿瘤体积增大(P﹤0.05)。RPMI8226细胞显著表达IL-17R。结论 IL-17在体内外均可促进RPMI8226细胞增殖,抑制其凋亡;RPMI8226细胞显著表达IL-17R。
2016年12期 v.29 1258-1261页 [查看摘要][在线阅读][下载 184K] [下载次数：143 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 范锋锋;李燕婷;金鑫;刘月萍;吴朝今;冯宜扬;乔瑞洁;许博;赵志强;谭小梅;谢贵林;
目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF(high sub)疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切(NcoⅠ和XhoⅠ)和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%~15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55~6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。
2016年12期 v.29 1262-1266页 [查看摘要][在线阅读][下载 285K] [下载次数：130 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王冬冬;张国利;岳玉环;吴广谋;田园;吉元刚;徐艳玲;张培培;侯天全;赵鑫;付玉和;
目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。
2016年12期 v.29 1267-1270页 [查看摘要][在线阅读][下载 210K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 罗勇;于荣清;兰芳;田继钊;张锐;
目的对植物蛋白胨培养基应用于23价肺炎球菌多糖疫苗规模化生产的效果进行初步评价。方法采用植物蛋白胨培养基,按生产规模进行肺炎球菌发酵培养和分离纯化多糖,检测大罐培养浓度、培养液多糖含量及精制多糖各项质量指标,并与现有23价肺炎球菌多糖疫苗生产用动物蛋白胨培养基相比较。结果与动物蛋白胨培养基相比较,使用植物蛋白胨培养基可提高肺炎球菌大罐培养浓度以及培养液多糖含量;精制多糖收率明显提高,各项质量指标均符合企业注册标准要求。结论在生产规模下,使用植物蛋白胨培养基生产的肺炎球菌精制多糖质量符合企业注册标准,且可较大幅度地提高精制多糖收率,为植物蛋白胨培养基应用于23价肺炎球菌多糖疫苗规模化生产奠定了基础。
2016年12期 v.29 1271-1273+1279页 [查看摘要][在线阅读][下载 133K] [下载次数：581 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 杨淼;朱衍志;刘东梅;赵一欢;蒋井明;刘晓凡;张静;
目的通过可比性分析确保灭菌注射用水生产场地变更前后质量的一致性。方法应用风险评估的方法对灭菌注射用水生产场地变更前后的材料、厂房设施、人员、生产工艺进行可比性分析,并对产品质量参数及稳定性试验的结果进行统计学分析。结果确认灭菌注射用水生产场地变更前后的材料及人员均一致,且确认厂房设施及生产工艺发生了变更,需经变更后连续3批上市规模的灭菌注射用水进行验证。生产场地变更后连续生产的3批产品与变更前连续2年生产的灭菌注射用水的关键质量指标p H、电导率、不挥发物的检定结果差异无统计学意义(P>0.05);3批灭菌注射用水加速稳定性试验6个月内p H为5.0~7.0,电导率≤25μS/cm(25℃),不挥发物≤1 mg。结论灭菌注射用水生产场地变更前后质量一致,均符合《中国药典》二部(2010版)的标准。
2016年12期 v.29 1274-1279页 [查看摘要][在线阅读][下载 213K] [下载次数：291 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 宁博林;刘勃麟;何倩毓;张莹;于江明;李修明;王秋菊;刘胜军;
目的探讨籽鹅Clock基因mRNA在繁殖周期下丘脑中的表达水平。方法选取休产期(1月份)、产蛋前期(3月份)、产蛋高峰期(4月份)、产蛋后期(6月份)的雌性籽鹅各6只,取其下丘脑组织样品用于抽提总RNA,克隆Clock基因,并进行实时荧光定量PCR分析。结果克隆得到了籽鹅Clock基因的部分CDS区序列,与鸭和鸡的对应核苷酸序列相似性分别为99%和96%。Clock基因在不同时期的雌性籽鹅下丘脑中均有表达,其mRNA表达水平从休产期到产蛋高峰期呈持续增长趋势,但产蛋末期开始下降。其中产蛋高峰期的表达水平显著高于产蛋末期(P<0.05),但与休产期和产蛋前期的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论籽鹅下丘脑中Clock基因mRNA的表达水平与当地日照时间长短密切相关,随着日照时间的延长,其表达量逐步提高,且在产蛋高峰期时达到峰值。本研究为阐述Clock基因调控鹅繁殖节律的分子机制提供了实验依据。
2016年12期 v.29 1280-1284页 [查看摘要][在线阅读][下载 315K] [下载次数：275 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张丽英;杜肖彦;赵鹏伟;
目的分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人结肠癌RKO细胞产生的β-防御素3(mouseβ-defensins-3,mBD-3)的影响。方法将不同浓度(0、10、20和40 ng/ml)的LPS作用于RKO细胞0、24、48和72 h,MTT法检测LPS对RKO细胞的最佳抑制浓度;定量RT-PCR及Western blot法检测LPS作用的RKO细胞中mBD-3的表达情况。结果 LPS对RKO细胞的抑制作用在浓度20 ng/ml、培养48 h时最佳。10、20和40 ng/ml LPS作用的RKO细胞,mBD-3 mRNA及蛋白表达水平均明显高于0 ng/ml LPS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LPS可以促进mBD-3的表达,为进一步研究mBD-3的产生机制奠定了基础。
2016年12期 v.29 1285-1287页 [查看摘要][在线阅读][下载 144K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 秦朝;官立萍;司艳莉;
<正>骨形态发生蛋白(bone morphologenetic protein,BMP)是转化生长因子β超家族的成员,可诱导原始间质细胞向骨与软骨趋化、增殖、分化。正常的BMP含量是维持骨的结构和功能的重要条件之一,BMP在体内诱导成骨的作用,已被REN等[1]证实。骨形态发生蛋白-2(BMP-2)为BMP家族中的重要成员。本文通过检测股骨头坏死模型大鼠阶段性病症,观察BMP-2在骨形成、骨愈合及治疗骨缺损中的作用,为股骨头坏死的治疗提供了新思路。
2016年12期 v.29 1288页 [查看摘要][在线阅读][下载 86K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 杨兰兰;张银川;吴小丽;张雅婷;桂芳;吴师师;闭兰;潘勇兵;
目的建立用于全人源抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体鉴别的毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,c IEF)方法,并进行验证。方法通过优化c IEF过程中各关键实验参数,如阴极稳定剂浓度、阳极稳定剂浓度、两性电解质浓度、3-10与8-10.5两性电解质比例、聚焦时间、聚焦电压,建立c IEF方法,并对方法的专属性、重复性、中间精密度进行验证。结果确定c IEF方法的实验参数为:阴极稳定剂浓度30 mmol/L,阳极稳定剂浓度3.2 mmol/L,3-10两性电解质在样品溶液中体积比为6.0%,聚焦电压为25 k V,聚焦时间为10 min。保护剂在样品出峰时间无紫外吸收峰,阳性对照阿达木单抗与样品出峰时间及峰形一致,阴性对照利妥昔单抗生物类似药、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗生物类似药、西妥昔单抗与样品出峰时间及峰形均不一致,且对样品无干扰;样品制备重复性主峰等电点的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为0.114%,中间精密度RSD为0.837%。结论建立的c IEF方法 p H梯度和精密度良好,专属性较强,适用于制品的批放行鉴别试验。
2016年12期 v.29 1301-1307页 [查看摘要][在线阅读][下载 447K] [下载次数：221 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈敬;刘钰;汤重发;刘梅影;魏博;
目的建立小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并进行验证,以进一步应用于疫苗免疫效果评价。方法根据幽门螺杆菌尿素酶B亚基(urease B,Ure B)在各菌株中相对保守的特性设计引物,优化其扩增条件,建立幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并对方法的专属性、精密性、准确性及检测限进行验证。结果所设计的引物在阳性样本中可特异性地扩增出目的基因片段,且小鼠胃部中其他菌体的存在不影响反应结果的特异性。标准品质粒DNA模板含量在1×107~1×102拷贝/μl范围内线性良好,相关系数r2大于0.995,扩增效率在90%~110%之间。应用于小鼠胃组织幽门螺杆菌检测,具有较好的准确性和精密性,回收率为96.25%~101.42%,试验内和试验间相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于6%。用该方法检测高、中、低浓度的Hp菌液、并模拟定量Hp菌株在小鼠胃组织中的状态,试验内及试验间RSD均小于6%,精密度良好。其回收率大于80%,与平皿计数法一样,但灵敏度显著高于平皿计数法。结论 SYBR GreenⅡ实时定量PCR法快速有效,专属性良好,线性范围广,可重复性好,使用方便,可用于定量检测幽门螺杆菌在小鼠胃部组织中的定植,从而进一步应用于评估免疫反应对细菌定植的影响。
2016年12期 v.29 1308-1315页 [查看摘要][在线阅读][下载 412K] [下载次数：235 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 周易;陆俭;张若晖;李小娟;魏子昊;张雪平;
目的运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染色和脱色方法,以便生产检定中实现数字化、标准化操作。方法以Photoshop软件对电泳凝胶扫描图采样的背景灰度值、强带灰度值和弱带灰度值作为评价指标,以不同的脱色液为实验因素,按配对设计安排实验,对实验结果进行脱色方法的统计学分析,根据配对设计分析结果,按裂区设计安排第二步实验,对实验结果进行染色和脱色方法的以统计学为主的综合分析评价。结果综合分析显示,电泳凝胶直接由考马斯亮蓝R250-磷酸-乙醇染色液加热至60℃染色2 h,0.5 mol/L KCl结合冰醋酸-甲醇脱色可获得良好效果。结论得到一种具有一定创新性的A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法,该方法具有背景脱色浅淡均匀,条带清晰,染色和脱色液不挥发因而重复性好的优点,能够满足A型肉毒毒素生产检定的需要。
2016年12期 v.29 1316-1320+1327页 [查看摘要][在线阅读][下载 258K] [下载次数：141 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 刘君;蔡觅;郑秀玉;张夕燕;王健;张振龙;
目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后经Butyl HP疏水层析和Q HP阴离子交换层析进行纯化。通过非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)检测样品纯度;质谱法测定rh CNTF的相对分子质量;Edman化学降解法测定rh CNTF的N-端氨基酸序列;TF-1细胞/CCK-8比色法和对饮食诱导性肥胖(diet-induced obesity,DDIO)大鼠的减肥作用分别测定rh CNTF的体外和体内生物学活性。结果纯化后rh CNTF的纯度可达99.6%,纯化回收率为34.5%;相对分子质量为21 153;N-端15个氨基酸序列为Ala-Phe-Thr-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Thr-Pro-His-Arg-Arg-Asp-Leu;生物学比活性高于2×106 IU/mg,并能有效降低DIO大鼠体重。结论经3步纯化成功获得了高纯度的rh CNTF,为进一步对其性质、功能和生产应用研究奠定了基础。
2016年12期 v.29 1321-1327页 [查看摘要][在线阅读][下载 384K] [下载次数：181 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 刘雄;余健;姚晶;黄梦;
目的建立人血清中猪抗人淋巴免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,ALG)双抗体夹心ELISA检测法,并进行验证。方法以兔抗猪Ig G包被酶标板,HRP酶标记的鼠抗猪Ig G为二抗,建立人血清中ALG含量的双抗体夹心ELISA检测法,并对方法中包被浓度及二抗浓度进行优化,同时验证该方法的重复性、敏感性、准确性、特异性及稳定性。采用优化后的方法对14位严重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)患者进行ALG的血药浓度监测(therapeutic drug monitoring,TDM)。结果最佳包被浓度为1∶2 000,最佳二抗稀释度为1∶8 000。参考品浓度在4.9~5 000μg/ml范围内标准曲线的四参数Logistic曲线拟合较好,R2值为0.991 1,在4.9~156μg/ml范围内的线性拟合也较好,R2值为0.991 5,批内重复性CV值均<10%;其检测底限为0.39μg/ml;浓度为500、50及5μg/ml参考品的回收率为91.2%~107.0%;该方法可特异性检测出注射ALG患者血清中ALG含量;包被好的ELISA板及二抗、底物于4及37℃条件下分别保存1~3周及1~3 d后检测结果均较稳定。经DAS 3.1.4软件分析,14名经ALG治疗的SAA患者血清中ALG的曲线下面积(AOC)为(7.3±5.1)mg/(L·d)(95%CI),半衰期(t1/2)为(20.65±38.67)d(95%CI)。结论该方法具有良好的重复性、准确度及稳定性,可用于ALG的TDM。
2016年12期 v.29 1328-1332页 [查看摘要][在线阅读][下载 224K] [下载次数：295 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李刚;马亚茹;陈俏丽;杨军;陈勇;蒋琳;
目的建立恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白(25 KDa Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25)的ELISA定量检测方法。方法以双抗体夹心ELISA法为基础,建立Pfs25蛋白的ELISA定量检测方法,并对该方法进行重复性和准确性验证。用建立的方法检测不同重组菌株、CHO细胞中,以及经10 L发酵罐培养菌株纯化各阶段样品中Pfs25蛋白的表达量。结果建立的方法线性范围为0~1.6μg/ml,R2=0.984,检测灵敏度为0.032μg/ml,回收率为81%~119.0%,CV﹤15%。Pfs25-Pet42a/DE3表达后的Pfs25蛋白浓度在2.03~7.26μg/ml;Pfs25-p GAPZαA/GS115、Pfs25-p PICZαA/GS115和(α-Pfs25)8-p AO815/GS115表达后的Pfs25蛋白浓度分别为113、105和280μg/ml;3株Pfs25/CHO细胞表达的Pfs25蛋白浓度分别为106.11、116.89和155.01μg/ml。p PICZαAPfs25/GS115菌株发酵液中,Pfs25蛋白的增加呈先快后慢的趋势,72 h后,目的蛋白增加逐渐平缓;纯化洗脱液3个峰中Pfs25蛋白浓度分别为22.67、42.12和55.27μg/ml,流穿液中Pfs25蛋白浓度仅为0.096μg/ml。结论建立的Pfs25蛋白ELISA定量检测方法可用于疟疾疫苗研究中Pfs25蛋白的定量分析。
2016年12期 v.29 1333-1336+1340页 [查看摘要][在线阅读][下载 239K] [下载次数：91 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 涂晶;何亮;方舸;周世忠;杨邦玲;
目的建立检测吸附无细胞百白破联合疫苗中游离甲醛含量的柱前衍生反相高效液相色谱法,并进行验证。方法以2,4二硝基苯肼(DNPH)为衍生剂,采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以70%乙睛溶液为流动相进行等度洗脱,流速为1 ml/min,检测波长为360 nm,进样量为10μl。对该方法的专属性、线性范围、精密度、准确度进行验证。用建立的方法检测10批吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量。结果DNPH、甲醛、戊二醛的保留时间分别为3.148、4.178和11.058 min,甲醛的拖尾因子为1.07,与戊二醛的分离度为26.8;甲醛浓度在20~100μg/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系,相关系数(r)为0.998 3;同一人员连续重复检测6次结果的相对标准偏差(RSD)为0.5%,2名人员于不同时间重复检测6次结果的RSD为0.6%;9份加标供试品溶液甲醛含量的回收率为101.0%~106.0%。10批吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量均符合规定。结论建立的柱前衍生反相高效液相色谱法具有良好的精密度及准确性,可用于测定吸附无细胞百白破联合疫苗中的游离甲醛含量。
2016年12期 v.29 1337-1340页 [查看摘要][在线阅读][下载 157K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 方哲翔;王建华;袁平;张其清;
目的验证和评价医用胶原修复膜制备工艺中过氧化氢溶液、低p H孵放和γ射线辐照灭活/去除病毒的可行性。方法以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、呼肠弧病毒Ⅲ(respiratory enteric orphan virusⅢ,Reo 3)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,采用非洲绿猴肾细胞(Vero)和猪肾细胞(PK-15)进行病毒增殖和感染性评价,Karber法测定病毒滴度;分别对牛腱片样品进行3%过氧化氢、低p H孵放处理(pH 3.4±0.3),检测病毒灭活/去除效果;将医用胶原修复膜中间品进行~(60)Coγ射线辐照(剂量为25 k Gy),检测病毒灭活/去除效果。结果经3%过氧化氢溶液处理1 h后,样品VSV和PRV的病毒灭活值均大于4 Logs;经低p H孵放处理14 d后,样品中已检测不到VSV和PRV,病毒灭活值分别为6.55和5.59 Logs;经25 k Gy剂量~(60)Coγ射线辐照处理后,样品中VSV、PRV、Reo3和PPV均被有效灭活,病毒灭活值分别为5.64、4.35、4.87和5.36 Logs。结论医用胶原修复膜制备工艺中的3种灭活/去除病毒步骤均有效,经灭活/去除病毒后的产品质量安全可靠。
2016年12期 v.29 1341-1345页 [查看摘要][在线阅读][下载 178K] [下载次数：405 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 黄敏;吕冰凌;袁良玉;易维维;吴朔华;曲芙莲;潘海龙;
目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。
2016年12期 v.29 1346-1348+1354页 [查看摘要][在线阅读][下载 188K] [下载次数：149 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]