- 冯凯;李建平;胡云光;王晶晶;王丽春;李剑兰;李琦涵;刘龙丁;
目的原核表达树鼩(tree shrew,ts)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因,并分析ts IL-6蛋白分子特征。方法以人、猴、啮齿类动物等IL-6 m RNA的共有序列作为查询序列,从树鼩c DNA数据库中进行本地blast,获得预测ts IL-6核苷酸序列,将其翻译成氨基酸序列,用MEGA 6软件进行核酸序列和氨基酸序列比对,绘制进化树。参考预测IL-6基因序列设计引物,PCR扩增IL-6基因序列,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6;转化感受态E.coli BL21(ED3),IPTG诱导表达,重组蛋白经14 KD透析膜梯度透析纯化;利用蛋白质在线数据库expasy进行蛋白质结构同源建模,并用Signal P sever预测ts IL-6的信号肽序列,经模板与预测模型的结构拟合来预测树鼩IL-6的gp130结合位点。结果 ts IL-6核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物有较高的同源性;重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6经双酶切鉴定证明构建正确;重组表达蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后可见单一目的条带,浓度为0.2 mg/ml;h IL-6和ts IL-6蛋白的空间结构较类似,ts IL-6的gp130结合位点Ⅱa位于A和C螺旋间,位点Ⅲa位于A和B螺旋的柔性链区及分子近C-端。结论 ts IL-6的核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物具有较高同源性,成功构建的重组原核表达质粒p ET-28a(+)-IL-6,为后续IL-6相关的病理研究奠定了基础。
2015年06期 v.28 557-563页 [查看摘要][在线阅读][下载 1745K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李向茸;冯若飞;包晓婧;张海霞;谢晶莹;徐雷;马忠仁;
目的构建小鼠碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF,亦称FGF-2)的真核表达质粒,并于无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中进行表达。方法以小鼠垂体组织总RNA为模板,PCR扩增b FGF基因,并克隆至真核表达载体p EGFP-C1,构建重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF,经Lipofectamine 2000介导转染无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞,荧光显微镜观察CHO-K1-SFS细胞中EGFP的表达情况,普通光学显微镜观察CHO-K1-SFS细胞的生长状况和细胞形态,RT-PCR法检测CHO-K1-SFS细胞中b FGF基因的转录,Western blot法检测CHOK1-SFS细胞中b FGF蛋白的表达。结果重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF经双酶切(BglⅡ/SalⅠ)鉴定证明构建正确;重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染后24、48、72及96 h的CHO-K1-SFS细胞均可见特异性绿色荧光蛋白表达,重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染对CHO-K1-SFS细胞形态和增殖速率不产生影响;p EGFP-C1-b FGF转染组CHO-K1-SFS细胞可扩增出510 bp的目的条带;p EGFP-C1-b FGF转染组可见相对分子质量约44 000的特异性条带,表达产物可与兔抗b FGF多克隆抗体发生特异性结合。结论构建的真核表达质粒p EGFP-C1-b FGF在无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中成功的表达,为进一步实现小鼠b FGF在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定了基础。
2015年06期 v.28 564-569页 [查看摘要][在线阅读][下载 1203K] [下载次数：196 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 田凤鸣;王瀚;卓平清;
目的在原核细胞中表达并纯化家蚕膜镁转运蛋白(Bombyx mori membrane magnesium transporter,Bm MMg T)。方法利用PCR法从家蚕蚕蛹c DNA文库中扩增Bm MMg T基因,对其进行生物信息学分析后,将该基因克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组克隆质粒p ET-32a-Bm MMg T,将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析柱和阴离子交换柱纯化后,进行SDS-PAGE鉴定。用无血清培养基(Mg2+饥饿)、镁离子终浓度分别为1、2、4、8 mmol/L的培养基培养Bm N细胞,设正常培养基培养的Bm N细胞作为对照,提取各组细胞总RNA,逆转录合成c DNA第1条链,以其为模板,荧光定量PCR检测体外Mg2+对Bm MMg T基因m RNA转录水平的影响。结果在c DNA文库中获得1个Bm MMg T基因,该蛋白是一个单次跨膜蛋白,等电点为6.7,相对分子质量约13 000。质粒p ET-32a-Bm-MMg T经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量为31 000,主要以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的60%,纯度约95%。与对照组细胞相比,处在镁饥饿状态下及不同浓度Mg Cl2处理的细胞,Bm MMg T基因m RNA转录水平差异均有统计学意义(P<0.05),且当Mg2+终浓度为4 mmol/L时,转录水平达到最高。结论成功在原核细胞中表达并纯化了Bm MMg T,并对其功能进行了初步探讨,为其后续的深入研究奠定了基础。
2015年06期 v.28 570-574+578页 [查看摘要][在线阅读][下载 1046K] [下载次数：126 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈振普;王海漩;胡凝珠;胡云章;
目的探讨甘氨酸锌(glycine zinc)对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分为7组:甘氨酸锌(200μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(400μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(200μg,p H 7.5)+HAV组、甘氨酸锌(400μg,p H 7.5)+HAV组、生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV抗原)和铝佐剂对照组(铝佐剂300μg+HAV抗原),每组8只。HAV抗原剂量均为18 EU,各组均经腹部皮下多点注射,200μl/只,免疫1次。免疫4、8、12、16周后,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV抗原特异性Ig G抗体水平,并进行安全性试验。结果除生理盐水对照组外,其他各组小鼠免疫4周后均产生抗-HAV Ig G,并随着时间的延长呈上升趋势,于免疫后第8周达峰值,此后逐渐下降。不同甘氨酸锌佐剂组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组。免疫后第8周时,铝佐剂对照组和甘氨酸锌佐剂组的抗体水平均显著高于HAV抗原对照组(P均<0.05);甘氨酸锌(400μg,p H 6.5)佐剂组抗体水平与铝佐剂对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论甘氨酸锌能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,其体液免疫增强效果与铝佐剂相当。
2015年06期 v.28 575-578页 [查看摘要][在线阅读][下载 758K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 任芳芳;徐婧雯;张雪梅;吴忠香;马娜;卢孔杰;董少忠;
目的克隆野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子,并分析其核苷酸、氨基酸序列的多态性及重要的功能位点。方法经野生型树鼩尾静脉采血,分离外周血单核淋巴细胞,经植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激24 h后,提取细胞总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物插入p MD-19T载体,提取阳性重组质粒,经双酶切鉴定及测序;采用Lasergene分析目的基因核苷酸及氨基酸序列,并构建进化树,分析野生型树鼩与已知中缅树鼩的亲缘关系。结果野生型树鼩CD4全长编码序列的开放阅读框长度为1 365 bp,编码454个氨基酸,IL-6全长编码序列的开放阅读框为627 bp,编码208个氨基酸,22只野生型树鼩成功克隆出CD4分子,23只野生型树鼩成功克隆出IL-6分子。不同野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子有不同程度的核苷酸和氨基酸位点的突变,但分别有35%和26.7%的碱基突变为同义突变,且发生非同义突变的位点对树鼩CD4和IL-6分子重要的功能位点无影响。由CD4核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树基本一致;由IL-6核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树中,23只野生树鼩分为2个分支。结论 CD4和IL-6分子具有重要功能的氨基酸位点是保守稳定的,为今后树鼩CD4和IL-6单克隆抗体的制备及树鼩实验动物模型的建立奠定了基础。
2015年06期 v.28 579-586页 [查看摘要][在线阅读][下载 1369K] [下载次数：170 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 孙建华;蒋惠婷;朱玉欣;刘嘉静;樊宵云;高远;倪宏波;
目的对猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur进行生物信息分析,并检测原核表达产物的抗原性。方法以猪B型多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增Fur基因,克隆至载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-Fur。利用生物信息学方法结合网络数据库测序分析Fur基因同源性、蛋白质理化特性、蛋白质结构并进行同源建模。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经透析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p GEX-6p-1-Fur经双酶切鉴定构建正确。Fur基因全长432 bp,编码144个氨基酸,与禽Pm70菌株的Fur基因同源性达99.8%,与嗜血杆菌属亲缘较近;Fur蛋白空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高,Fur蛋白为酸性脂蛋白,Fur蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,107-117位氨基酸区域作为抗原表位可能性较大,且Fur无跨膜区与信号肽,是相对成熟稳定的蛋白。以2w57.1.A为模板构建了可靠的三维结构分子模型。重组蛋白GST-Fur相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的33%,纯化后纯度达92%,重组蛋白GST-Fur可与多杀性巴氏杆菌制备的血清发生特异性结合。结论于E.coli中成功表达了重组蛋白GST-Fur,构建了可靠的三维结构模型,为进一步研究Fur蛋白功能及毒力作用机制奠定了基础。
2015年06期 v.28 587-592+597页 [查看摘要][在线阅读][下载 1805K] [下载次数：162 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 何福果;陈晏林;林晓;赵涌;
目的分析脑星形细胞胶质瘤组织中CD105与CD248的表达情况,并探讨其意义。方法采用免疫组织化学染色法检测128份不同分级的脑星形细胞胶质瘤组织及16份正常脑组织中CD105与CD248的表达。结果正常脑组织中未检测到CD105与CD248的表达。胶质瘤组织中CD105与CD248的阳性表达率分别为69.71%和58.59%,且胶质瘤病理级别与二者的表达呈正相关(P<0.01)。结论 CD105与CD248在星形细胞胶质瘤组织中的表达与肿瘤恶性程度有关,其可能参与了脑星形细胞胶质瘤的发展,以二者为靶点的抗血管生成疗法将为星形细胞胶质瘤的生物治疗提供新的方向。
2015年06期 v.28 593-597页 [查看摘要][在线阅读][下载 671K] [下载次数：104 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 朱玉兰;谢放;吴萍民;
目的对一株祁连山大型野生食用菌进行分离鉴定,并分析其生物学特性。方法经组织分离获得野生菌株QL-8,提取其基因组DNA,以其为模板扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段,并进行测序及系统发育分析。采用单因素试验方法检测温度(18、20、22、24、26、28℃)、p H值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、碳源(蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、葡萄糖)、氮源(硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、尿素)、无机盐(硫酸铁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁)、维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12、VB复合)对菌丝生长的影响。使用不同栽培料(棉籽壳、木屑、粪草)对野生菌进行栽培试验。结果菌株QL-8属于毛头鬼伞属,Gen Bank登录号为KF702392。菌丝生长的最适温度为24~26℃,最适p H为7.0,最适碳、氮源分别为蔗糖和酵母粉,添加一定量的硫酸镁和VB6有助于菌丝的生长。该菌株于木屑培养料中生长最快,满袋后覆土即可出菇。结论成功获得了菌株QL-8的生长特性和出菇条件,并培育出野生毛头鬼伞子实体,为天然野生菌实现人工栽培提供了实验依据。
2015年06期 v.28 598-604页 [查看摘要][在线阅读][下载 705K] [下载次数：344 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ]
- 王明清;管娇琼;龙艺;朱文勇;廖国阳;
目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖间接竞争ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以Hib多糖—酪胺结合物(PRP-Ty)作为包被抗原,待测PRP作为竞争抗原,与Hib抗血清反应,建立间接竞争ELISA检测方法。采用棋盘法确定最佳包被多糖抗原浓度及Hib抗血清稀释倍数,绘制标准曲线,并确定最低检测限;对建立的方法进行批内和批间精密性验证;取Hib发酵液,在培养温度、接种量等因素相同的情况下,分别将培养液初始p H调至6.0±0.02、7.0±0.02和8.0±0.02,培养不同时间取样,采用建立的方法检测培养液内PRP含量。结果 PRP-Ty的最佳包被浓度为1.25μg/ml,Hib抗血清的最佳稀释倍数为300倍。该方法检测的线性范围为6.25~200 ng/ml,最低检测限为6.25 ng/ml,回归方程为y=-23.12 x+99.62,R2=0.996。采用该方法分别重复检测3次高浓度(200 ng/ml)和低浓度(20 ng/ml)PRP多糖的变异系数(CV)分别为1.608%和3.344%;采用该方法及传统化学检测法分别检测6次同一批Hib成品分装疫苗的多糖,该方法检测结果的CV值为5.75%,传统化学法检测结果的CV值为1.98%,均符合要求;该方法检测不同初始p H培养液培养的Hib发酵液,培养时间为8 h左右时,PRP产量最高;当初始p H为8.0±0.02时,培养液内PRP含量增长最快,所达到的浓度最高。结论建立了Hib多糖间接竞争ELISA检测方法,该方法灵敏度较高,精密性良好,可应用于Hib多糖含量的定量检测。
2015年06期 v.28 623-627页 [查看摘要][在线阅读][下载 325K] [下载次数：275 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 孙振鹏;李欢;孙燕;孟子新;赵星文;范秀娟;李薇;
目的建立生物反应器内微载体上Vero细胞球转球胰酶消化放大技术。方法用500 ml搅拌瓶培养Vero细胞,待细胞浓度达1.8×106个/ml时,加入25和37℃消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)消化不同时间,计算细胞回收率及细胞活率,筛选微载体细胞最佳培养温度及消化时间。将3 L反应器内微载体及T25方瓶培养的Vero细胞消化后接种T25方瓶,比较两种传代方式下的细胞形态及比生长速率。将3 L反应器内微载体培养的Vero细胞用消化液消化后,按1∶3、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例接种至15 L反应器,确定最适接种比例。将转瓶及3 L反应器内微载体培养的Vero细胞消化后接种至15 L反应器,比较两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率。结果微载体上培养的Vero细胞经25℃消化15 min可有效保证细胞的回收率及活率。两种传代方式下的细胞形态及比生长速率无明显区别。细胞比生长速率在1∶6~1∶10比例放大时较高。两种放大方式下的细胞形态、密度及比生长速率无明显区别。结论初步建立了生物反应器微载体内细胞的胰酶消化球转球放大技术,Vero细胞存活率较高,贴壁良好,空珠率较低,可应用于生物反应器微载体培养系统的规模放大。
2015年06期 v.28 628-632页 [查看摘要][在线阅读][下载 880K] [下载次数：656 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 刘杰;孙艳;刘辉;康庄;毛川成;刘莉娜;陈智;牟建超;赵宇;刘俐;杨会强;李玉华;
目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。
2015年06期 v.28 633-635+640页 [查看摘要][在线阅读][下载 438K] [下载次数：269 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 郭采平;王春华;周兰贞;刘永娣;罗姗;张剑平;周维;
目的优化鸡胚细胞(chick embryo cells,CECs)培养狂犬病病毒(rabies virus,RV)的工艺。方法以M199为基础培养基,向其分别加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES缓冲液,并均加入碳酸氢钠,配制培养基M1、M2和M3。将驯化获得的CTNCEC25株按1∶5 000的比例接种于CECs悬液中,在不同培养条件下,通过单因素试验初步确定培养基配方、培养温度、接种MOI及培养时间4大工艺参数范围,再以正交试验确定上述条件的最佳组合。结果单因素试验初步确定的工艺参数:采用M2或M3,培养温度为33~36℃,MOI=0.01~0.001 FFU/细胞,培养时间为72~120 h,可获得较高的病毒滴度(7.0 lg FFU/ml以上)。正交试验确定的最佳工艺条件:采用M3,培养温度为33℃,MOI=0.01 FFU/细胞,培养时间为120 h,该工艺参数获得病毒滴度可达7.5 lg FFU/ml。结论本实验优化了CECs培养RV的工艺,CTNCEC25株的病毒滴度由约6.0 lg FFU/ml提高至7.0 lg FFU/ml以上,为疫苗生产获得理想抗原量奠定了基础。
2015年06期 v.28 636-640页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] [下载次数：303 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 朱卫华;宗向坤;胡小华;胡月凤;杜琳;
目的制备福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物,并检测其免疫原性。方法水解的福氏2a志贺菌O-特异性多糖在碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的介导下,与己二酰二肼(adipic acid dihydrazide,ADH)缩合,制备衍生物,再与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)结合制备福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物(以下简称结合物),并检测各项生化指标。分别用多糖、本实验制备结合物、氰基活化法和氨还原法制备的结合物免疫小鼠,0.2 ml/只(含2μg多糖),共免疫3次,每次免疫2周后检测小鼠血清抗体滴度,并计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果结合物游离多糖和游离蛋白含量均较低,内毒素含量合格,KD值由约0.85(多糖)降至0.02(结合物)。各结合物均可诱导小鼠产生特异性抗体,且各组间GMT差异无统计学意义(P>0.05),各针次间GMT均有显著提高(P<0.05)。结论本实验制备的福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物具有良好的免疫原性,且制备方法步骤简单,反应条件温和,适合用于规模化生产。
2015年06期 v.28 641-644页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K] [下载次数：66 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 李肖锋;孔双泉;翟志芳;宋梦薇;马骉;
目的建立检测牛纤维蛋白原中磷酸三丁酯残留量的方法,并进行验证。方法采用气相色谱法。色谱条件:色谱柱为酸修饰交联聚乙二醇毛细管色谱柱-20M(30 m×0.25 mm×0.25μm),溶剂为正己烷,气化室190℃,检测器210℃,柱温140℃,高纯氮气载气(99.999%),流速1.0 ml/min,不分流,进样量0.1μl。确定磷酸三丁酯的定量限和最低检测限,对方法进行精密性、线性及准确性验证,并用该方法检测3批样品。结果磷酸三丁酯的定量限和最低检测限分别为0.830 6和0.207 6 ng;精密性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.138 6%,磷酸三丁酯的线性范围为2.129 0~17.032 0μg/ml,回归方程y=5.317 7 x+1.096 1,R2=0.997 3,低、中、高3个剂量样品的平均回收率分别为100.596 9%、98.597 5%和99.712 5%,RSD分别为0.641 2%、0.553 7%和1.009 5%。3批样品中磷酸三丁酯残留量分别为3.259 6、3.287 9、3.193 3μg/ml。结论该方法简便、准确、可靠,可用于血液制品中磷酸三丁酯残留量的质量控制。
2015年06期 v.28 645-647+653页 [查看摘要][在线阅读][下载 280K] [下载次数：219 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ]