- 王娇;刘伟;胡秦;李泽琳;曾毅;
目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。
2015年04期 v.28 339-343页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K] [下载次数：271 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：983 ] - 王陈芸;孙静;李萍;余柄廷;李建芳;李彦涵;王海漩;乌美妮;胡凝珠;胡云章;
目的探讨硫酸软骨素B(chondroitin sulfate B,CSB)佐剂对甲型肝炎病毒((hepatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其佐剂效果。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l18 EU+不同剂量CSB(5、25、45、65、85、105μg)组、阴性对照组(生理盐水)、抗原对照组(Hep A-l 18 EU)和铝佐剂对照组[Hep A-l 18 EU+Al(OH)3300μg],每组8只,各组均经皮下注射ICR小鼠,200μl/只。于免疫后的第4、8、12和16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV特异性Ig G抗体水平。在实验期间,观察小鼠的健康状况,并于免疫16周后,取CSB 65μg组及阴性对照组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏各主要器官,制备病理切片,进行对比观察。结果各组小鼠免疫后第4、8、12、16周,均产生抗-HAV Ig G抗体,除阴性对照组外,抗体水平均随时间的延长逐渐升高,于第8周达峰值,此后逐渐下降。CSB 65μg组抗体可长时间维持在高水平,至免疫后第12、16周,均高于抗原对照组(P<0.05),略高于铝佐剂对照组,最佳浓度为65μg/只。实验期间,各组小鼠均未出现异常;CSB65μg组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织均未观察到病变。结论 CSB可明显增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,具有成为新型疫苗佐剂的研发价值。
2015年04期 v.28 344-347页 [查看摘要][在线阅读][下载 246K] [下载次数：191 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：2540 ] - 许雅鑫;吴彬;游锦梅;李钰;Yang Yong;陈显久;
目的构建细胞因子信号抑制因子1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因真核高表达质粒,并在口腔上皮细胞系NOK细胞中进行表达。方法提取健康人外周静脉血基因组DNA,PCR扩增SOCS1基因,与p EGFPN1载体连接,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1,用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定及测序后,转染NOK细胞,采用荧光显微镜及Western blot法检测转染细胞中SOCS1蛋白的表达。结果重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1经双酶切及测序鉴定证实构建正确。p EGFP-N1-SOCS1转染NOK细胞72 h后获得表达,SOCS1蛋白的表达量为(134.67±9.07)%,较转染空质粒组约升高4倍,二者差异有统计学意义(P=0.001)。结论成功构建了SOCS1基因真核高表达质粒,为进一步研究SOCS1的生物学功能奠定了基础。
2015年04期 v.28 348-351页 [查看摘要][在线阅读][下载 230K] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1059 ]
- 卫辰;裴宇盛;晁哲;骆鹏;谭亚军;王丽婵;马霄;侯启明;
目的对氢氧化铝佐剂吸附的无细胞百白破联合疫苗(diphtheria,tetanus and acellular pertussis combined vaccine,adsorbed,DTa P)成品中内毒素含量进行测定,确定将内毒素检查方法纳入2015版《中国药典》中百白破类疫苗质量标准的可行性和必要性。方法参考《中国药典》三部(2010版)附录ⅫE建立动态浊度法,测定解吸附前后DTa P中细菌内毒素含量,并进行标准曲线的可靠性及干扰试验验证。结果该方法在0.005~10 EU/ml范围内线性较好,r=-0.997 1。干扰试验样品回收率在50%~200%。实测样品内毒素值从低于检测限至433 EU/ml。不同厂家及同一厂家不同批次产品解吸附前后的内毒素测定值差异显著,CV值在36.9%~89.0%之间。结论该方法可靠性、线性、回收率、灵敏度均符合要求,为进一步制定DTa P相关质量标准提供参考。现有热原检测方法不能全面反映DTa P成品中内毒素水平,有必要将内毒素检测纳入DTa P质量标准,以更好地控制疫苗安全性。
2015年04期 v.28 385-389页 [查看摘要][在线阅读][下载 169K] [下载次数：373 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：1265 ] - 李阿妮;于旭博;罗树权;胡浩;孔素娟;袁菲;杨英英;刘方蕾;吴兵;陈作江;赵志强;谢贵林;
目的建立基于核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术检测C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal capsular polysaccharide,GCMP)、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖(GYMP)和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖(GWMP)化学结构的方法。方法建立1H-NMR检测方法:使用布鲁克600 MHz超导傅里叶核磁共振谱仪,配置5 mm BBO正向宽带高分辨液体探头。脉冲程序为水峰压制(zgpr),温度为298 K(25℃)。具体参数设置如下:中心频率约为4.7 ppm;图谱宽度为7 211 Hz;采样时间为2.272 s;弛豫延迟时间为2 s;扫描次数为512次;信号经傅里叶转换后加入1.0 Hz的窗口函数,检测结果使用Topspin 3.0软件进行处理。验证该方法的专属性、重复性及中间精密性。结果 5批GCMP、GYMP和GWMP检测结果的CV值均小于0.35%;3个浓度GCMP、GYMP和GWMP在相同的操作条件下以及不同工作日间、不同实验员间的检测结果的CV值均小于0.35%。结论建立的1H-NMR检测方法简便、快速、准确,检测GCMP、GYMP和GWMP具有极高的专属性、重复性和中间精密性,适用于疫苗生产研究中GCMP、GYMP和GWMP样品的定性结构鉴定。
2015年04期 v.28 390-397页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K] [下载次数：471 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：2288 ] - 夏青娟;徐艳玲;李树林;禇东琳;候丽娟;翁滨;肖想;邱璐;徐晓霞;刘令九;
目的建立检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度的细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction,strand-specific RT-PCR)方法。方法根据甲型肝炎病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条特异性引物。将甲型肝炎减毒活疫苗原液感染2BS细胞,收获增殖高峰期的HAV,提取RNA,进行2轮链特异性PCR扩增,检测HAV复制过程中的负链RNA,通过Reed-Muench公式计算HAV病毒滴度,并对建立的细胞培养/链特异性RT-PCR法进行特异性及敏感性验证,同时用该方法检测4批冻干甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度,并与《中国药典》三部(2010版)中甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度检测方法(细胞培养时间为28 d/ELISA法)进行比较。结果 HAV负链RNA经2轮扩增获得阳性扩增条带,大小与预期相符。该方法检测HAV复制过程中的负链RNA,特异性、敏感度均较好。两种方法检测的病毒滴度接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的细胞培养/链特异性RT-PCR方法检测周期短,灵敏度、特异性好,可用于疫苗的滴度检测。
2015年04期 v.28 398-401页 [查看摘要][在线阅读][下载 249K] [下载次数：357 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：2265 ] - 杨烨;廖丹;谢姗姗;李青耘;王静;
目的建立测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗中蔗糖含量的旋光法,并对方法进行验证。方法建立旋光法,检测b型流感嗜血杆菌结合疫苗中的蔗糖含量,并对方法进行专属性、线性范围、重复性、准确性、耐用性和稳定性验证。结果 b型流感嗜血杆菌结合疫苗中其他组分对蔗糖旋光度无干扰;蔗糖浓度在2~10 mg/ml范围内与旋光度具有良好的线性关系(r=0.999 998);重复测定供试品溶液6次,相对标准偏差(RSD)为0.46%;低、中、高浓度的供试品平均回收率分别为99.18%、99.14%、98.95%;温度在10~30℃范围内对旋光度无明显影响;样品于20℃放置5 h内旋光度无明显变化。结论建立了旋光法检测b型流感嗜血杆菌结合疫苗中蔗糖含量的方法,该方法操作简单快速,在确定的限度范围内具有较好的专属性、重复性、准确性、耐用性和稳定性。
2015年04期 v.28 411-413+417页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：174 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1041 ] - 廖丹;杨烨;李青耘;谢姗姗;王静;
目的建立测定23价肺炎球菌多糖疫苗的关键原辅材料—过氧化氢酶活性的方法,并进行验证。方法分别采用高锰酸钾滴定法和紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性,并对紫外分光光度法进行重复性、日间精密度、不同人员间精密度、耐用性、线性验证。结果两批样品重复测定6次结果的RSD均<5%;两批样品两名检测人员3日内的检测结果以及两批样品不同工作日间的检测结果差异均无统计学意义(P>0.05),样品日间和人员间检测结果的RSD均<5%;在20~30℃温度范围内该方法耐用性良好,在p H 7.0~7.5范围内耐用性良好;该方法在样品浓度为0.2~1.6μl/ml之间的线性关系良好。结论分光光度法重复性、日间精密度、不同人员间精密度良好,且操作简便,结果可靠,适用于过氧化氢酶的质量控制。
2015年04期 v.28 418-421+425页 [查看摘要][在线阅读][下载 195K] [下载次数：2276 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：23 ] |[阅读次数：2349 ] - 田来明;杨滨僮;李智鹏;张桐嘉;宫鹏涛;李建华;王全楷;杨举;李赫;张西臣;
目的建立检测鹿新孢子虫感染的双抗夹心Dot-ELISA方法,并进行初步应用。方法以双抗夹心ELISA方法的A490值对应Dot-ELISA方法显色结果的方式,建立双抗夹心Dot-ELISA方法检测结果判定标准,确定HRP标记的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1H11、包被抗体(抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体1A1)、待测血清的最佳工作浓度,并对该方法的特异性、重复性及灵敏度进行验证。用建立的方法检测79份鹿血清,并与双抗夹心ELISA方法进行比较。结果确定该方法 HRP-H11抗体的最佳稀释度为1∶100,包被抗体最适工作浓度为0.3μg/片,待测血清稀释度为1∶8。自然感染犬新孢子虫的鹿阳性血清的敏感性稀释度为1∶64,与弓形虫阳性血清无交叉反应,敏感性、特异性较强;自然感染新孢子虫的鹿阳性血清3次检测结果重复性较好。该方法检测的76份鹿血清中,阳性12份,阳性率为15.2%,与双抗夹心ELISA方法检测结果一致。结论建立的双抗夹心Dot-ELISA方法可用于检测鹿群感染新孢子虫循环抗原,为新孢子虫病的诊断提供了新的方法。
2015年04期 v.28 422-425页 [查看摘要][在线阅读][下载 222K] [下载次数：204 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：2639 ]