- 李岩;王大南;杨芳莉;桑力轩;朱俊丰;李胜军;孙逊;吕昌龙;
目的制备口服CD226 DNA疫苗,观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法以质粒CD226-PCR2.1-ToPo为模板,PCR扩增CD226基因,克隆至pcDNA3.1载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD226,利用脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染CT-26细胞株,采用RT-PCR法、Western blot法、流式细胞术检测CD226基因在CT-26细胞中的表达。将质粒pcDNA3.1-CD226用脂质体Lipofectamine TM2000包裹制成CD226 DNA疫苗(100μg质粒/100μl脂质体),经灌胃免疫C57BL/6小鼠,实验分CD226疫苗组、pcDNA3.1组和生理盐水组,流式细胞术检测CD226在小鼠脾细胞中的表达;还原酶法检测NO分泌水平;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、IFNγ和TNF-α)分泌水平;Real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平。结果质粒pcDNA3.1-CD226经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒pcDNA3.1-CD226转染CT-26细胞的转染率为32.14%,转染的CT-26细胞检测到CD226蛋白表达。CD226疫苗组CD226 CD4+T细胞的绝对数、NK细胞杀伤活性、NO分泌水平、脾细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-2分泌水平、肠黏膜组织内TNF-α和IFNγ基因mRNA水平均明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P<0.05);而CD226疫苗组脾细胞培养上清中IL-4分泌水平及肠黏膜组织内IL-2和IL-4基因mRNA水平,与pcDNA3.1组和生理盐水组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CD226DNA疫苗经灌胃免疫,可诱导小鼠全身Th1型免疫应答增强和肠道局部部分Th1型免疫应答增强。
2014年05期 v.27 585-590页 [查看摘要][在线阅读][下载 358K] [下载次数：121 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 郑惠文;杨晓蕾;刘龙丁;顾琴;陈梦娇;许秀雯;曹洁;徐丽兰;孙明波;杨净思;
目的比较原位共沉淀法(以下简称原位法)和直接吸附法制备的乙型肝炎疫苗的免疫效果。方法采用原位法和直接吸附法制备乙型肝炎疫苗。将小鼠随机分为5组,即原位法疫苗组、直接吸附法(本所佐剂)疫苗组、直接吸附法(进口佐剂)疫苗组、佐剂对照组(铝佐剂+PBS)和空白对照组(PBS),分别于0、4、8周经小鼠腓肠肌免疫,0.1 ml/只,按照《中国药典》三部(2010版)进行疫苗吸附完全性试验及疫苗体外相对效力检测。于初免后第1、2、4、8、12、16周,经小鼠尾动脉采血,分离血清,采用ELISA法测定血清中Anti-HBs水平;于初免后第4、8、12周,各组分别取5只小鼠,经尾动脉采血,分离血清,采用流式细胞术,检测血清中T淋巴细胞亚群分布;于初免后第12周,各组分别取5只小鼠,无菌取脾,分离得到脾单个核细胞(mononuclear cell,MNC),采用酶联免疫斑点试验(enzymelinked immunospot assay,ELISPOT)法检测血清中HBsAg特异性IFNγ分泌水平。结果原位法疫苗组、直接吸附法(本所佐剂)疫苗组、直接吸附法(进口佐剂)疫苗组HBsAg吸附效率分别为95%、95%和96%,疫苗体外相对效力分别为2.2、2.1和2.3,均符合《中国药典》三部(2010版)要求。各疫苗组Anti-HBs阳转率均达到100%,随接种剂次的增加,Anti-HBs水平逐渐升高,于初免后第12周达到高峰,第16周出现下降;初免后第8周,原位法疫苗组Anti-HBs GMT高于直接吸附法(本所佐剂)和直接吸附法(进口佐剂)疫苗组,差异均有统计学意义(P<0.05),初免后第4、12、16周,差异无统计学意义(P>0.05)。初免后第4、8、12周,各组小鼠血清中CD3+CD4+T细胞水平均未见明显改变,第12周,各疫苗组CD3+CD8+T细胞水平均高于免疫前,差异有统计学意义(P<0.01)。各疫苗组分泌IFNγ的斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数明显高于铝佐剂对照组和空白对照组;原位法疫苗组与直接吸附法(本所佐剂)和直接吸附法(进口佐剂)疫苗组相比,SFC数差异无统计学意义(P>0.05)。结论两种方法制备的乙型肝炎疫苗均具有较好的免疫效果。
2014年05期 v.27 591-596页 [查看摘要][在线阅读][下载 362K] [下载次数：355 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨喆;丁敏;王丽丽;李伟;周长征;徐娅妮;李镭;马波;
目的比较不同浓度配比的CpG ODN和Al(OH)3佐剂乙型肝炎疫苗的免疫原性。方法按乙肝表面抗原浓度为20μg/ml,分别加入3个浓度的Al(OH)3(300、400、500μg/ml)和CpG ODN(125、250、500μg/ml)佐剂,按不同配比制备9组不同佐剂浓度的疫苗样品,以不加CpG ODN佐剂的疫苗作为对照。将各组疫苗样品分别按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256共5个稀释度稀释后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,第5周检测血清中抗-HBs水平,计算抗体阳转率及半数有效量(ED50);将各组疫苗样品分别于第0和28天经左前胫肌肉免疫BALB/c小鼠,分别于第1次免疫后第2、4、6、8、10周检测体液免疫应答水平,第5周检测细胞免疫应答水平。结果不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品免疫小鼠后,ED50均小于0.2,对照组疫苗的ED50为0.235。不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品小鼠血清抗体滴度均高于对照组,且抗体产生时间略提前;Al(OH)3浓度为400和500μg/ml时,疫苗诱导小鼠产生的抗体滴度与CpG ODN佐剂浓度呈正相关。对照组诱导产生的IFNγ水平均较其他疫苗组低;随着A1(OH)3浓度的升高,同一CpG ODN浓度的疫苗样品诱导IFNγ的水平逐渐下降;相同A1(OH)3浓度下,低浓度CpG ODN组斑点形成细胞数(spot-forming cell,SFC)均值较高,而高浓度组SFC均值较低。结论 A1(OH)3和CpG ODN作为双佐剂系统协同乙型肝炎疫苗,不仅能增强体液免疫应答,还能诱导IFNγ的表达,激活Th1细胞免疫应答,比传统A1(OH)3单佐剂乙型肝炎疫苗更具优势,其中CpG ODN和Al(OH)3浓度均为500μg/ml的疫苗制剂免疫原性最佳。
2014年05期 v.27 596-600页 [查看摘要][在线阅读][下载 335K] [下载次数：264 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 李梅芳;毛芝娟;韩雨杉;童阳阳;许健;
目的制备壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌外膜蛋白(outer membrane protein,omp)K微球疫苗,并检测其对大黄鱼的口服免疫效果。方法采用乳化-离子交联法制备副溶血弧菌ompK微球疫苗,筛选表面活性剂司盘-80添加量及壳聚糖包被浓度,经正交试验优化微球疫苗的制备工艺,筛选微球疫苗的冻干保护剂。检测采用优化条件制备的微球疫苗的理化特性及其在不同条件下的释放特性,并将微球添加到饵料中,连续5 d投喂大黄鱼,第28天以副溶血弧菌zj2003攻击,检测口服微球疫苗的免疫保护率。结果最适司盘-80添加量为2%~4%,壳聚糖包被浓度为0.6%~0.7%;优化的微球疫苗制备条件为:抗原蛋白浓度10 mg/ml,海藻酸钠浓度1.0%,水油比1∶2,搅拌速度2 000 r/min;微球疫苗的最佳冻干保护剂为2%甘露醇;以优化的条件制备的微球圆整性、分散性好,平均直径为(1.91±1.02)μm,表现出酸性条件稳定、中性和弱碱性条件溶胀的特性;微球疫苗口服免疫的大黄鱼对副溶血弧菌zj2003攻击表现出中等程度的保护力。结论制备了壳聚糖-海藻酸钠包被的副溶血弧菌ompK微球疫苗,并验证了其口服免疫的有效性,为鱼类口服弧菌疫苗的研制及应用奠定了基础。
2014年05期 v.27 601-606页 [查看摘要][在线阅读][下载 459K] [下载次数：456 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ]
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<正>《中国生物制品学杂志》于1988年创刊,由中华人民共和国卫生部主管,系中华预防医学会系列杂志之一,为报道我国生物制品研究开发重大成果和最新进展的国内唯一生物制品专业学术期刊。主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域,如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。主要设有疫苗研究、基础研究、治疗性制剂、诊断制剂、临床研究、技术方法、研究简报、综述、述评、专题报道、会议快讯、消息等栏目。
2014年05期 v.27 590页 [查看摘要][在线阅读][下载 120K] [下载次数：12 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域,如预防医学、免疫学、微生物学、生物化学、流行病学、临床医学等方面的研究、生产、使用和质控等学术文章。在选择来稿时注
2014年05期 v.27 595页 [查看摘要][在线阅读][下载 127K] [下载次数：10 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] -
<正>为了对稿件的接收和审理管理更加规范,本刊自2013年5月1日起,启用了CNKI腾云期刊协同采编系统,作者投稿及修稿等事宜均请通过本刊网站(www.zgswj.com.cn)进行。
2014年05期 v.27 600页 [查看摘要][在线阅读][下载 127K] [下载次数：12 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>尊敬的专家、读者、作者及各位同仁:您们好!自2007年8月起,《中国生物制品学杂志》网站(www.zgswj.com.cn,中文域名:中国生物制品学杂志.com)正式运行。本站网页有杂志简介、在线投稿、稿件查询、过期目录、广告合作等您所需要的信息,欢迎登录。
2014年05期 v.27 606页 [查看摘要][在线阅读][下载 173K] [下载次数：14 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] -
<正>由中国食品药品检定研究院副院长王军志研究员主编的《生物技术药物研究开发和质量控制》一书自2002年10月首次出版以来,在生物技术药物领域获得了广泛好评。应科学出版社约稿和广大读者要求,主编及编委们对原著进行了补充和修订。第二版仍分为上下两篇,共30章。上篇系统地介绍了生物技术药物的研制、开发和非临床研究的全过程以及贯穿于全过程的质量控制要点和技术要求,同时在原有内容基础上,增加了生物技术药物药效学研究和临床观察的章节,并根据药效学研究基本原则,结合生物技术药物特点作了详细
2014年05期 v.27 675页 [查看摘要][在线阅读][下载 121K] [下载次数：20 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>2014年时值《中国免疫学杂志》创刊30周年之际,并恰逢我国著名微生物学、生物制品学,微生态学专家魏曦院士诞辰110周年,拟定于2014年8月8日~11日在贵州省遵义市召开《中国免疫学杂志》创刊30周年暨纪念魏曦院士诞辰110周年学术研讨会,会议特邀国内外免疫学与微生物学相关领域的著名专家学者、《中国免疫学杂志》各位编委、支持帮助过《中国免疫学杂志》的同行及读者、魏曦院士的亲友同事及学生、从事免疫学与微生物学的广大基础及临床科研人员共聚一堂,以庆祝《中国免疫学杂志》创刊30周年,回顾《中国免疫学杂志》30年的成长历程及成果,缅怀和弘扬魏曦院士正直的为人、严谨的学风、渊博的学识,以进一步促进国内外免疫学与微生物学的基础及临床学术交流及探讨。
2014年05期 v.27 726页 [查看摘要][在线阅读][下载 123K] [下载次数：20 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 姜广菊;李华;杨婷;刘正玲;谢天宏;龙润乡;岳磊;罗芳宇;谢忠平;
目的对引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type16,CA16)临床分离株的生物学特性进行分析,为后续的疫苗研发奠定基础。方法从昆明地区HFMD临床疑似患者178份咽拭子及粪便标本中分离并鉴定CA16毒株,并对病毒的生长特性、蚀斑形态以及对乳鼠的致病性等生物学特性进行分析。结果共分离出7株CA16病毒:KM1、KM15、KM154、KM165、KM168、KM263、KM881,均属于B1亚型;病毒在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4~6 d即可达到增殖高峰,但感染性滴度差别较大,最低为4.75 lgCCID50/ml,而最高可达7.78 lgCCID50/ml;各毒株在Vero细胞上培养相同时间形成的蚀斑形态不同,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,KM1、KM881、KM263、KM165蚀斑较大,不规则,边缘较模糊;各毒株毒力均较强,经乳鼠颅内注射后,乳鼠均于3~6 d陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及病毒致死性死亡率均达100%;各毒株对乳鼠的脑、心肌、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织均有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉。结论分离的CA16毒株对Vero细胞均具有良好的适应性,蚀斑清晰,毒力较强,且多数毒株感染性滴度较高,可用于CA16病毒致病机理的研究及疫苗的研发。
2014年05期 v.27 607-611+616页 [查看摘要][在线阅读][下载 486K] [下载次数：170 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 李露;王化磊;赵国星;齐瑛琳;郑学星;冯娜;赵永坤;王铁成;李忠义;高玉伟;冯烨;杨松涛;夏咸柱;
目的比较3株来自我国不同地区的狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的生长特性,为建立狂犬病病毒感染模型奠定基础。方法分别通过乳鼠脑内接种和细胞培养法进行连续传代,测定不同代次SXYQ、YN01和GDMMD57株狂犬病病毒街毒株的病毒滴度,计算半数细胞感染量(TCID50)。结果 SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒乳鼠脑内接种传代至10代,病毒滴度随传代次数的增加,呈上升趋势,至第8代后,病毒滴度趋于稳定,分别为105.85、105.63和105.97 TCID50/g,不同毒株间病毒滴度存在差异。SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒接种N2a细胞后,随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性不断增强,病毒滴度呈上升趋势,至第15代后,病毒滴度趋于稳定,不同毒株间病毒滴度存在差异;第20代SXYQ株病毒的滴度在感染后2.5 d达到峰值(106.80 TCID50/ml),YN01和GDMMD57株病毒滴度在感染后3 d达到峰值(均为107.30 TCID50/ml)。结论 3株病毒在细胞和乳鼠脑内经连续传代后均能达到较高滴度,可用于狂犬病病毒感染模型的建立及新型疫苗的研究。
2014年05期 v.27 612-616页 [查看摘要][在线阅读][下载 412K] [下载次数：263 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 刘振兴;崔亚洲;刘超;栾静;周小艳;韩金祥;
目的构建成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)基因野生型和E731K突变型的真核表达载体,并进行鉴定。方法利用基因定点突变试剂盒,定点突变FGFR2基因,获得其E731K突变的突变型基因,通过设计含有XbaⅠ、XhoⅠ限制性内切酶识别序列的引物分别扩增FGFR2基因野生型和E731K突变型的cDNA,克隆至质粒pcDNA3.1-EGFP上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP,利用X-tremeGENE HP DNA将质粒转染至HEK293细胞,采用实时荧光定量PCR法及Western blot法检测FGFR2表达水平。结果经定点突变已获得野生型的突变型FGFR2基因,碱基序列与设计序列完全一致,cDNA第2191位碱基G突变为A。重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP经双酶切及测序鉴定证明构建正确。质粒转染HEK293细胞后,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达;质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP转染组中FGFR2 mNRA和蛋白表达水平均明显高于质粒pcDNA3.1-EGFP转染组和空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了FGFR2基因野生型和E731K突变型的真核表达质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究FGFR2基因奠定了基础。
2014年05期 v.27 617-621页 [查看摘要][在线阅读][下载 412K] [下载次数：67 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张颂;徐江峰;翁雅倩;
目的研究低温乙醇法工艺生产的抗人T细胞猪免疫球蛋白的有效期。方法将3批经全面检定合格的抗人T细胞猪免疫球蛋白置(6±2)℃贮存36个月,分别于0、3、6、9、12、18、24、30、36个月取样,参考《中国药典》三部(2005版)中抗人T细胞猪免疫球蛋白检测方法和标准,对制品外观、pH值、纯度、蛋白含量、分子大小分布以及效价进行检定。将E玫瑰花环形成抑制试验及淋巴细胞毒试验的标示量与贮存时间结果导入Excel,使用6SQ统计加载项,进行一元线性回归,选择时间和预测区间的上或下限作散点图,在散点图中选择添加趋势线,如可观察到预测区间的上限值呈线性,可在趋势预测/回归分析类型中选择线性,获得拟合方程,将标示量带入方程中,计算获得有效期。结果根据E玫瑰花环形成抑制试验效价测定结果,理论推算在(6±2)℃条件下保存时,有效期可达41~100个月;根据淋巴细胞毒试验效价测定结果,理论推算在(6±2)℃条件下保存时,有效期可达47.9~64.3个月。结论初步确定抗人T细胞猪免疫球蛋白制品有效期为30个月。
2014年05期 v.27 622-625+631页 [查看摘要][在线阅读][下载 367K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 邹颜阳;李琼;李雄武;张徽;
目的探讨硫氧还蛋白-1(sulfiredoxin-1,Srxn-1)对H2O2诱导的PC12细胞超氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法在Lipofectamine 2000的介导下,分别将pLVT574、pLVT575和pLVT576干扰质粒转染PC12细胞,同时设空白对照组(正常培养细胞)及阴性对照组(转染pLVT4质粒),普通显微镜和倒置荧光显微镜下观察转染效率,并采用RT-PCR和Western blot法分别检测转染细胞中Srxn-1基因mRNA转录和蛋白表达的水平。采用不同终浓度(50、100、150、200、250、300μmol/L)的H2O2诱导PC12细胞,建立超氧化细胞损伤模型,MTT法检测Srxn-1对细胞存活率的影响,并采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒检测细胞SOD活性及MDA含量。结果镜下观察可见,转染后细胞死亡数较多,胞体缩小;有绿色荧光,转染效率达50%。si-Srxn-1-575组细胞中Srxn-1基因mRNA转录及蛋白表达水平较空白对照组明显下降(P<0.05)。终浓度为200μmol/L的H2O2处理12 h后,PC12细胞的存活率为66%;H2O2+si-Srxn-1-575组的细胞存活率(49.3%)明显低于空白对照组(65.2%)(P<0.05)。H2O2+si-Srxn-1-575组细胞中SOD活性[(10.319±1.362)U/mg pro]明显低于H2O2+空白对照组[(15.7±1.138)U/mg pro],MDA含量[(5.507±0.297)nmol/mg pro]明显高于H2O2+空白对照组[(3.41±0.281)nmol/mg pro](P均<0.05)。结论 Srxn-1对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与其发挥内源性抗氧化作用有关。
2014年05期 v.27 626-631页 [查看摘要][在线阅读][下载 468K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杨静;杨春;何永林;徐蕾;冯鑫;张春燕;穆柳青;
目的探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor,PMA)对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素(granulysin,GLS)表达的激活作用。方法分别用不同浓度的PMA(130、160、180 nmol/L)诱导THP-1细胞24 h,RT-PCR法检测细胞中GLS基因mRNA的转录,筛选PMA最佳诱导浓度;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24和48 h,RT-PCR法检测GLS基因mRNA的转录,筛选最佳诱导时间;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24、48和72 h,Western blot法检测GLS蛋白的表达,免疫细胞化学法检测48 h时GLS蛋白的表达。结果以160 nmol/L的PMA诱导THP-1细胞24 h,细胞中GLS基因mRNA的转录水平最高;诱导48 h后可检测到GLS蛋白大量表达。结论 PMA可激活THP-1细胞中GLS的表达,本实验为后续进一步研究GLS表达的调控机制奠定了基础。
2014年05期 v.27 632-635页 [查看摘要][在线阅读][下载 425K] [下载次数：170 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 邵会媛;栾材富;刘杰;张守信;马新衡;张贵丽;孙成铭;
目的构建稳定表达转录因子增强子结合蛋白α(CCAAT-enhancer-binding proteinα,C/EBPα)基因的白血病髓性细胞系。方法利用DNA重组技术将C/EBPα基因插入到慢病毒表达载体PLVX-EGFP-3FLAG-Puro中,构建重组慢病毒质粒PLVX-C/EBPα-3FLAG-Puro,与慢病毒包装辅助质粒plp1、plp2、plp/VSVG(1∶1∶1)共转染293细胞,包装出慢病毒,实时荧光定量PCR法检测病毒滴度;收集病毒,分别以10、20 MOI感染K562细胞,G418筛选阳性克隆,利用有限稀释法筛选稳定转染的单克隆细胞株,并采用Western blot法检测C/EBPα蛋白的表达。结果重组慢病毒质粒PLVX-C/EBPα-3FLAG-Puro经菌落PCR及测序鉴定证明构建正确;包装后的慢病毒pSB957的病毒滴度为5×106 TU/ml;pSB957-K562细胞中C/EBPα蛋白的表达水平较高,且20和10 MOI pSB957感染的K562细胞中,C/EBPα蛋白的表达水平无明显差异。结论成功构建了pSB957-K562白血病细胞株,为进一步研究C/EBPα在白血病发生发展中的作用提供了良好的细胞模型。
2014年05期 v.27 636-638+641页 [查看摘要][在线阅读][下载 416K] [下载次数：70 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 陈嘉雯;王佳凤;徐俊峰;周欣;曲成;陈维金;
目的对国产及进口MEM培养基培养MRC-5细胞的效果进行比较。方法用国产及进口MEM培养基培养37代MRC-5细胞,于显微镜下观察培养24、48、72 h后的细胞的生长情况,并对细胞在33~37代传代过程中的细胞活性进行检测;以0.008 MOI的Oka株水痘-带状疱疹病毒感染37代MRC-5细胞,观察细胞病变情况。结果国产及进口MEM培养基培养的37代MRC-5细胞,细胞形态、贴壁、伸展、牵手、成网、单层等生长情况均相似,细胞数量也无明显差异,均可使细胞保持较高的活力,两组间细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05);细胞病变均比较典型、广泛,病变程度均在70%以上,且细胞完整,未见明显撕裂现象。结论国产及进口MEM培养基均可满足MRC-5细胞的生长和病毒培养的宿主条件。
2014年05期 v.27 639-641页 [查看摘要][在线阅读][下载 433K] [下载次数：486 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 张元新;葛雅琨;施维;
目的探讨水飞蓟宾(silibinin)与阿霉素(doxorubicin)联合作用对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响及其机制。方法用不同浓度的水飞蓟宾、阿霉素单独或联合作用SGC-7901细胞,采用MTT法检测细胞增殖的活力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化;Western blot法检测细胞周期调控蛋白Cdk1、Cyclin B1和细胞凋亡调控蛋白pro-caspase 3、pro-caspase 8、pro-caspase 9、PARP、Fas、Fas L表达量的变化及Bcl-2/Bax的比例。结果 0.01μmol/L阿霉素联合水飞蓟宾(25、50、100、200μmol/L)作用SGC-7901细胞后,产生了明显的协同作用,联合作用指数(combined index,CI)分别为0.634、0.418、0.224、0.472,有效提高了细胞的抑制率,同时降低了Cdk1和Cyclin B1蛋白的表达量,引起细胞G2/M期阻滞;Fas和Fas L的表达量升高,pro-caspase 3/8/9的表达量降低,PARP被剪切,Bcl-2/Bax的比例降低,促使SGC-7901细胞凋亡。结论水飞蓟宾与阿霉素联合作用SGC-7901细胞后,水飞蓟宾能有效降低阿霉素的使用浓度,并提升其诱导凋亡的效果。
2014年05期 v.27 642-646页 [查看摘要][在线阅读][下载 570K] [下载次数：171 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 李妍;范泉水;张志晓;郭平;叶锋平;姜晓梅;邱薇;张富强;郑颖;敖琳;
目的测定东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch,BMK)蝎毒的毒性,并制备能有效中和BMK蝎毒的F(ab’)2抗体。方法分别经腹腔和肌肉注射小鼠,测定不同产地(山西、山东、河南、辽宁)BMK蝎毒对小鼠的半数致死量(LD50);以山西产BMK蝎毒免疫云南矮种马,获得免疫血浆,经盐析、酶解、加热等步骤制备F(ab’)2抗体,采用ELISA、免疫扩散和小鼠体外中和试验分别测定超免血浆、纯化的IgG及F(ab’)2抗体对各地产BMK蝎毒的抗体效价。结果山西产BMK蝎毒的LD50最小,小鼠腹腔注射的LD50为1.67 mg/kg,肌肉注射LD50为2.06 mg/kg。制备的F(ab’)2抗体的纯度为86.5%;纯化的IgG稀释至1×10-9 mg/ml,抗体ELISA效价呈阳性,较纯化前(1×10-7 mg/ml)提高了100倍;纯化的IgG和制备的F(ab’)2抗体与山西产BMK蝎毒比例为0.4∶1时,免疫扩散试验出现清晰的沉淀线,与其他产地BMK蝎毒比例均为0.1∶1时,出现清晰的沉淀线;F(ab’)2抗体与山西产BMK蝎毒质量比为2∶1时,可保护小鼠100%存活。结论成功利用蝎毒免疫动物制备了高纯度的F(ab’)2抗体,该抗体可有效中和多个产地的BMK蝎毒。
2014年05期 v.27 647-651页 [查看摘要][在线阅读][下载 470K] [下载次数：180 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 何睦;谭小钉;卢日峰;刘大涛;王志武;
目的分析人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质,并初步筛选其结晶条件。方法分别采用还原、非还原SDS-PAGE及高效液相体积排阻色谱(size exclusive chromatography-HPLC,SEC-HPLC)法检测抗体纯度;还原SDSPAGE测定抗体轻重链相对分子质量;毛细管电泳测定抗体等电点;高效液相阳离子交换色谱(ion exchange chromatographyHPLC,IEC-HPLC)法检测抗体电荷异质体含量;悬滴气相扩散法初步筛选抗体的结晶条件。结果人源化抗CD20单克隆抗体的非还原SDS-PAGE纯度为100%,还原SDS-PAGE纯度(轻链+重链)为100%,重链、轻链相对分子质量分别为58 000和27 000,SFC-HPLC纯度为99.2%;等电点为9.2;抗体表面电荷分布较均一;得到的蛋白晶体为孪晶,分辨率约为8埃。结论该抗体的纯度达到结晶要求,以其理化性质为基础,初步筛选出了结晶条件,为其结构和功能的研究奠定了基础。
2014年05期 v.27 657-660页 [查看摘要][在线阅读][下载 492K] [下载次数：353 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 刘哲;张峰;李丽阳;姚晓颖;武瑞;
目的探讨西洋参皂苷(Panax quinquefolius saponin,PQS)对缺血-再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)诱导乳鼠心肌细胞凋亡及钙浓度的影响。方法将原代培养的心肌细胞分为正常对照组(不做任何处理)、I/R组(心肌细胞经缺氧、无血清孵育2 h,再复氧、复血清培养24、48 h,以模拟心肌I/R损伤)和西洋参总皂苷干预组(PQS+I/R,细胞再灌注时分别加入5、10、20、40μg/ml PQS),采用台盼蓝染色法检测各组心肌细胞的活性;流式细胞术检测心肌细胞的凋亡率;激光扫描共聚焦显微镜检测心肌细胞内游离钙的变化。结果与I/R组比较,10、20、40μg/ml PQS+I/R组心肌细胞活性显著增加(P<0.01),心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05);20μg/ml的PQS可降低心肌细胞的钙负载。结论 PQS可显著减少I/R诱导的心肌细胞凋亡,并减轻心肌细胞钙超载的发生,这可能是PQS抑制I/R心肌细胞凋亡的机制之一。
2014年05期 v.27 661-663+670页 [查看摘要][在线阅读][下载 491K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ]
- 王凤双;吴殚;肖雷;冯冉;唐莹;
目的了解北京市顺义区常住人口麻疹抗体水平。方法选择2012年在北京市顺义区连续居住6个月以上的11个年龄组人群作为调查对象,共243名。采用调查问卷,收集调查对象的人口学特征、麻疹患病史、含麻疹成分疫苗免疫史,并采用ELISA法检测研究对象麻疹抗体水平。结果调查对象麻疹抗体阳性率为83.13%(202/243),抗体水平中位数为939.23 IU/L。男性与女性的麻疹抗体阳性率、抗体水平以及本市人口与流动人口麻疹抗体阳性率、抗体水平差异均无统计学意义(P均>0.05);有免疫史者与无免疫史者和免疫史不详者间,麻疹抗体阳性率及抗体水平差异均有统计学意义(P均<0.05),有免疫史者抗体水平高于无免疫史者和免疫史不详者。本市和流动人口麻疹抗体阳性率均以8~11月龄最低,分别为37.50%、14.29%;均以0~7月龄、1~4岁、5~9岁、35~39岁组最高,为100%,其中15~19、20~24、25~29和30~34岁组流动人口麻疹抗体阳性率均高于本市人口,差异有统计学意义(P均<0.05)。本市和流动人口麻疹抗体水平中位数均以0~7月龄最低,分别为72.51、96.07 IU/L;最高的年龄组本市人口为8~11月龄(3 940.12 IU/L),流动人口为30~34岁组(3 661.33 IU/L),其中25~29、30~34、35~39岁组流动人口麻疹抗体水平中位数高于本市人口,差异有统计学意义(P均<0.05),1~4岁组本市人口麻疹抗体水平中位数高于流动人口,差异有统计学意义(P<0.05)。本市和流动人口共调查≤14岁儿童93名,81.72%的人曾接种过含麻疹成分疫苗,接种1、2、3剂次及以上疫苗的人群,麻疹抗体阳性率在92.61%~100%之间,差异无统计学意义(P>0.05),抗体水平中位数差异无统计学意义(P>0.05)。但本市儿童不同免疫剂次间麻疹抗体阳性率、抗体水平中位数差异有统计学意义(P均<0.05)。结论北京市顺义区常住人口中,1~9岁儿童麻疹抗体水平较高,发生大范围麻疹暴发和流行的风险较小,<1岁婴儿麻疹抗体水平有待进一步提高,应进一步探索本市15岁以上年龄组免疫策略,以降低该人群发病风险。
2014年05期 v.27 671-675页 [查看摘要][在线阅读][下载 475K] [下载次数：148 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：0 ] - 乔建国;周凤岩;李玉莹;修冬莹;邢辉;李峥;赵薇;刘红亮;
目的分析吉林市HIV感染者中HIV-1型对常用治疗药物的基因型耐药情况。方法采集吉林市接受抗病毒治疗的HIV-1感染者血样,提取RNA,采用巢式PCR法扩增HIV-1基因,利用ABI 3100测序仪进行核苷酸序列测定;用Sequencher 4.9对测定的序列拼接,用Bioedit软件进行多序列比对及序列清理后,与Stanford HIV Drug Resistance Database中的参考株序列进行比较,分析耐药基因突变及耐药结果。结果 49名HIV感染者中发现27人耐药,耐药率55.1%。检测出反转录酶(RT)区耐药突变位点8个,其中核苷类反转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcripase inhibitors,NRTIs)类中,15例M184V和3例M41L突变,对应拉米夫定(Lamivudine,3TC)/恩曲他滨(Emdtricitabine,FTC)耐药15例和齐多夫定(Zidovudine,AZT)/司他夫定(Stavudine,D4T)耐药7例;非核苷类反转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcripase inhibitors,NNRTIs)类中,13例K103N、8例V106I、6例Y181C及4例P225H突变,对应奈韦拉平(Nevirapine,NVP)耐药26例、依非韦伦(Efavirenz,EFV)耐药25例和利匹韦林(Rilpivirine RPV)耐药14例。蛋白酶(PR)区仅发现次要耐药突变(A71V/T/I和L10I/V),未造成相应药物的耐药。结论吉林市HIV感染者中耐药率较高,应加强耐药监测,拟定患者个性化治疗方案。
2014年05期 v.27 676-678+683页 [查看摘要][在线阅读][下载 435K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张文涛;梁平;代鹏;王伟华;汪钦;孙建斌;王伟;颜真;
目的应用Logistic回归与多因子降维法(multifactor dimensionality reduction,MDR)分析胃癌易感基因多态性,为胃癌的早期诊断和预警奠定基础。方法采用病例-对照研究,以中国西北476例汉族胃癌患者为病例组,361名非肿瘤、非消化系统疾病个体为对照组;通过候选基因策略,应用MassARRAY质谱平台分析与代谢、炎症相关的18个基因的37个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点;利用Logistic回归与MDR对基因分型结果进行分析。结果 Logistic回归分析显示,磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1,PLCE1)_rs3765524[OR=1.341,95%CI(1.003,1.792)]、还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]_rs1800566[OR=0.615,95%CI(0.418,0.903)]、X线修复交叉互补基因1(X ray repair cross complementing gene 1,XRCC1)_rs25487[OR=0.688,95%CI(0.490,0.967)]3个SNP位点的基因型分布与胃癌易感性显著相关(P<0.05);MDR分析显示,PSCA_rs10216533-XRCC1_rs25487[模型Ⅰ:OR=3.566,95%CI(2.614,4.863)]、MTHFR_rs1801131-PSCA_rs2976392-CYP17A1_rs6163-CYP19A1_rs4646-CYP19A1_rs1902586-MMP2_rs243865[模型Ⅱ:OR=7.257,95%CI(5.337,9.870)]、IL1B_rs16944-PSCA_rs10216533-CYP17A1_rs6163-NQO1_rs1800566-ENOSF1_rs2298581-XRCC1_rs25487[模型Ⅲ:OR=15.837,95%CI(11.252,22.289)]3个模型内部各位点之间具有显著交互作用(P<0.000 1)。结论 PLCE1、NQO1、XRCC1、PSCA、MTHFR、CYP17A1、CYP19A1、MMP2、IL1B、ENOSF1等基因多态性与我国西北地区汉族人群胃癌发病风险相关;在胃癌的早期诊断与预警中应联合Logistic回归和MDR等方法,兼顾单因素与多因素交互的影响进行综合分析。
2014年05期 v.27 679-683页 [查看摘要][在线阅读][下载 516K] [下载次数：744 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 常利民;郑治敬;翟春艳;
目的分析2010年1月1日~2012年12月31日天津市宁河县百日咳流行病学特征及病例直接花费情况,为下一步预防和控制百日咳提供参考依据。方法利用描述流行病学方法,采用Excel 2003对2010年1月1日~2012年12月31日天津市法定传染病报告系统百日咳个案调查资料进行统计学分析,利用天津市疾病预防控制中心设计的"百日咳病例疾病负担调查表"中数据分析病例花费情况。结果 2010~2012年天津市宁河县共报告16例百日咳,平均发病率为1.28/10万;夏秋季高发,6~10月的病例占81.2%;87.5%的病例发生在农村地区;发病年龄最小的为1月龄,最大的为28岁,<1岁的病例占62.5%,发病率明显高于大龄儿童及成人;16例百日咳中,5例有免疫史,7例未到接种月龄,4例无免疫史;发病至初次就诊时间间隔中位数为13 d;11例为实验室诊断病例,5例为临床诊断病例,临床表现以痉挛性咳嗽、呕吐、口唇青紫等为主,有5例合并支气管肺炎;共有12例住院病例,二、三级医疗机构各6例,住院病例平均花费8 846元。结论农村地区百日咳发病率较高,应提高免疫服务质量并加强百日咳预防知识的宣传。婴幼儿监护人如有咳嗽等相关症状应积极就诊,降低病原传播风险。应加强百日咳的预防和控制,以减轻家庭的经济负担。
2014年05期 v.27 684-686页 [查看摘要][在线阅读][下载 431K] [下载次数：205 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：1 ]
- 耿兴良;戴宗祥;段盼盼;郭琦;宋绍辉;寸怡娜;姜述德;廖国阳;
目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。
2014年05期 v.27 687-690页 [查看摘要][在线阅读][下载 527K] [下载次数：573 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 徐江峰;张颂;
目的两种常用抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin)制备工艺的对比。方法以人T淋巴细胞免疫的健康猪血浆为原料,采用硫酸铵-Sephadex A-50和Cohn低温乙醇法,经醛化人健康红细胞、醛化人胎盘渣及混合人血浆吸收后,制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录,进行中间品及成品检定。结果用硫酸铵盐析法与低温乙醇法连续分别制备了3批产品,每批投浆量约5 000 ml;3批中间品鉴别试验及3批成品检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,两种工艺方法均适用于制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,但在质量和收获率上,低温乙醇法更具优势。结论低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白更适用于生产。
2014年05期 v.27 691-694页 [查看摘要][在线阅读][下载 435K] [下载次数：298 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 丁建坤;彭育才;邓巧春;何丽秀;闫鸿鹏;谭清清;谢亦武;
目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。
2014年05期 v.27 695-699页 [查看摘要][在线阅读][下载 578K] [下载次数：308 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 牛冬云;连炜;邬智刚;郝晓峰;柯潇;
目的建立测定融合蛋白制剂中聚山梨醇酯20(Tween 20)含量的荧光偏振检测方法,并进行验证。方法利用疏水性荧光染料DAF(5-dodecanoylaminofluorescein)与Tween 20胶束内的非极性核心结合,在485 nm激发波长下产生的荧光偏振强度与溶液中胶束浓度呈正相关,来确定样品中的Tween 20浓度。对建立的方法进行专属性、准确性、精密性、拟合度验证。结果该方法的专属性较好,可排除检测体系中蛋白的干扰;该方法重复检测3次高(250μg/ml)、中(150μg/ml)、低(50μg/ml)、定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ,25μg/ml)浓度样品的平均回收率均在(100±20)%的可接受范围内,批内和批间变异系数均小于15%;标准曲线拟合度良好。结论立的荧光偏振法专属性、准确性、精密性良好,可用于蛋白制剂中Tween 20含量的测定,并适用于稳定性考察过程中Tween 20有效浓度的监测。
2014年05期 v.27 700-704页 [查看摘要][在线阅读][下载 552K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 陈川;朱思宇;李丽;胡淑媛;罗都强;
目的采用常规PCR法快速鉴别不同种属来源的粗品肝素钠。方法通过柱回收和胶回收两步回收法,从粗品肝素钠中提取动物残留核酸,以其为模板,通过常规PCR法进行种属来源的鉴定。分别以猪、羊来源的核酸为模板,用3种种属特异性引物(猪、羊1、羊2)进行PCR扩增,验证引物的特异性;对柱回收、胶回收和两步回收法提取的核酸样品及含不同比例(1%、5%、10%、15%)羊来源肝素钠的混合样品进行PCR检测;并检测3批次肝素钠样品的种属来源。结果猪的引物能特异性扩增猪来源的核酸,羊的引物能特异性扩增羊来源的核酸;采用单一胶回收和柱回收法提取的残留核酸,不能有效地利用常规PCR鉴定种属来源,而两步回收法提取的残留核酸,能有效地利用常规PCR鉴定种属来源;采用两步回收法提取核酸,可检测到含1%羊来源肝素钠的混合样品;3批次的肝素钠样品中均混有羊肝素钠。结论常规PCR法操作简便迅速,成本较低,可用于不同种属来源的粗品肝素钠的定性检测。
2014年05期 v.27 705-708页 [查看摘要][在线阅读][下载 524K] [下载次数：226 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 扈会平;赵淑媛;唐正均;李云富;曾娟梅;孙玉龙;刘兵;黄剑波;
目的对鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)病毒灭活工艺进行验证。方法以伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)和Sindbis病毒为指示病毒,考察辛酸钠法对mNGF原液中病毒的灭活效果,并比较灭活后与未灭活原液的mNGF活性、纯度、等电点及其-20℃贮存0、3、6个月的稳定性。结果 mNGF原液经0.3%辛酸钠、pH(5.0±0.2)、(25±1)℃灭活90 min,PRV和Sindbis病毒滴度均下降6 lgCCID50/ml以上,灭活60、90 min样品盲传3代后,均未检测出病毒。灭活后与未灭活原液的mNGF活性无差异,比活性均在5.0×105 AU/mg以上,蛋白纯度均为100%,等电聚焦主区带均在8.65~9.30之间;-20℃贮存0、3、6个月,蛋白纯度均为100%,比活性均无明显差异,且6个月内比活性均未明显降低。结论辛酸钠法可安全、快速、高效地灭活mNGF原液中的指示病毒及其所代表的相关病毒,保证了产品的质量及其工艺的稳定性,保障了临床用药的安全性。
2014年05期 v.27 709-711+715页 [查看摘要][在线阅读][下载 538K] [下载次数：120 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 郭妍;惠长野;张文;王佃鹏;高朝贤;杨学琴;
目的从牛肺中提取基因组DNA,并分析其质量。方法通过单因素试验考察不同NaCl浓度(0.6、0.8、1.0 mol/L)和水解温度(55、75℃)对组织蛋白水解及DNA释放的影响;采用酶解-沉淀法,按照单因素试验确定的酶解条件提取4批牛肺基因组DNA(100221、100301、100305、100322):二步钙盐沉淀法选择性沉淀DNA,获得DNA钙盐,并进行钠置换,获得DNA钠盐。对提取的牛肺基因组DNA进行质量分析,并考察牛肺新鲜程度对DNA终产品分子量的影响。结果 0.6 mol/L NaCl,55℃酶解4 h可保证组织蛋白充分水解及基因组DNA完全释放;经二步钙盐沉淀制备的DNA纯度符合药用标准,但DNA产率不稳定,DNA分子量分布较宽,产率最低的100305批DNA小分子丰度最高;牛肺冻存处理导致DNA分子严重降解。结论采用酶解-沉淀法从牛肺中提取了基因组DNA,对拓宽去纤苷及其类似物的来源具有重要意义。
2014年05期 v.27 712-715页 [查看摘要][在线阅读][下载 519K] [下载次数：128 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王宁;佟雪莲;边雅静;周思杭;李静;王奔;唐玉龙;
目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50~1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%~117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。
2014年05期 v.27 716-719页 [查看摘要][在线阅读][下载 556K] [下载次数：422 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 张波;靳征;徐秀玲;鲍禹凡;李景华;
目的优化复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,并进行验证。方法利用中心复合设计(central composite design,CCD)法对影响复合阴离子交换层析的3个因素(上样液pH值、上样液电导率值、上样量)进行优化,拟合出响应曲面,找出最优参数范围。将优化的Capto adhere层析工艺与亲和层析相结合,纯化CHO细胞表达的IgG1单抗培养液,验证工艺参数的稳定性。结果优化的Capto adhere层析工艺为:上样液pH值6.9,上样液电导值率6.3 mS/cm,上样量300 mg/ml gel;CHO细胞表达的IgG1单抗培养液先经蛋白A亲和层析柱初步纯化,再经优化的Capto adhere层析工艺进一步纯化后,样品纯度达98.9%,蛋白A残留量为0.000 52%,宿主细胞蛋白残留量为0.015%,与预测值比较,结果偏差小于10%,且均符合质控标准,两步层析总收率达86.7%。结论优化了复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,利用亲和层析与Capto adhere复合阴离子交换层析两步法纯化单抗是有效、简便、可行的。
2014年05期 v.27 720-724页 [查看摘要][在线阅读][下载 618K] [下载次数：702 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李长青;薛永常;
<正>黑曲霉是发酵工业广泛应用的重要菌种,可产生葡萄糖氧化酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖酸、柠檬酸等重要物质,且产量较高。通过基因工程方法进行表达已成为提高产物产量主要的方法之一,而从黑曲霉中提取高纯度的DNA是基因克隆的前提条件。黑曲霉属于丝状真菌,因其细胞壁多糖与几丁质含量较高,细胞壁结构坚固,提取DNA的过程中破壁困难,对提取DNA的纯度与质量会造成一定的影响。目前,提取黑曲霉基因组DNA的方法较多,本实验旨在对实验室常用的5种快速提取黑曲霉基因组DNA的方法进行比较,为今后合理选择DNA提取方法及方法的改进提供实验依据。
2014年05期 v.27 725-726页 [查看摘要][在线阅读][下载 350K] [下载次数：540 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]