- 李勋;任丽;康延申;牛德云;郝彦玲;何彦平;邵一鸣;齐智;
目的构建、表达不同片段1型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的膜蛋白三聚体,并检测其免疫原性。方法以中国主要流行株HIV-1CRF_07 BC亚型基因为模板构建pFUSE-gp160重组质粒,以pFUSE-gp160为模板构建pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF重组质粒,将重组质粒分别转染293F细胞,转染120 h后,收获上清,经Ni-NTA superflow、nProtein A SepharoseTM4 Fast Flow及Superose 12 Prep Grade分子筛纯化后,分别进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将各重组蛋白联合MF59佐剂经大腿肌肉注射免疫豚鼠,100μg/只,分别于第1、30及60天各免疫1次,初次免疫前7 d及末次免疫后第90天心脏采血,分离血清,ELISA法及假病毒系统分别检测血清特异性抗体效价及中和抗体滴度。结果质粒pFUSE-gp160、pFUSE-gp140FF、pFUSE-gp120FF、pFUSE-gp41FF、pFUSE-N55FF、pFUSE-N28FF经测序鉴定构建正确。各纯化蛋白的SDS-PAGE及Western blot鉴定均可见目的条带,gp120FF和gp140FF均可高通量表达,其表达量分别为6和2.5 mg/L,gp41FF、N55FF和N28FF蛋白的表达量均低于0.5 mg/L,纯化后的纯度均较高。gp140FF组和gp120FF组豚鼠血清抗体效价分别为3.2×105和5.33×105、中和抗体滴度分别为405和462,均显著高于其他组(P<0.05)。结论 gp140FF和gp120FF能诱导豚鼠产生较强的体液免疫反应和中和抗体,本实验为HIV-1疫苗的研发提供了参考。
2014年02期 v.27 145-150页 [查看摘要][在线阅读][下载 630K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 程鹏飞;刘朝阳;闫现伟;
目的分析2013年流感疫苗生产用甲型H3N2(NYMCX-223A)毒株主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征,并检测该疫苗株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性。方法对制备的H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检测;采用RT-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析;应用MEGA 5.05软件对7株不同年份的H3N2亚型疫苗株的HA氨基酸序列进行比对,绘制基因种系发生树。结果 H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批抗原性与2013年度WHO推荐毒株相一致,其他生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;主要抗原HA基因序列长度为1 701 bp,编码566个氨基酸;NA基因序列长度为1 410 bp,编码469个氨基酸,各代次流感病毒HA和NA基因核苷酸和氨基酸序列均一致,与GenBank公布的序列完全一致,同源性为100%。2013年与2012年H3N2疫苗株HA氨基酸序列相比,同源性为97.5%。2013年与2012年H3N2疫苗株具有较远的进化距离,与同源性结果相对应。结论 2013年甲型H3N2(NYMCX-223A)流感疫苗株主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合《中国药典》三部(2010版)要求。2013年与2012年H3N2疫苗株序列差异较大。
2014年02期 v.27 151-155页 [查看摘要][在线阅读][下载 742K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘向芹;张影;张金龙;张瑾;王国柱;田喜凤;辛晓芳;
目的比较两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为02、03佐剂组、Pr组和NS组,每组24只。02、03佐剂组、Pr组分别经大腿内侧肌肉注射15μg恶性疟原虫融合蛋白-2.9(combine protein 2.9 of Plasmodium falciparum,PfCP-2.9)+15μg恶性疟原虫环孢子蛋白-2(circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum 2,PfCSP-2)+02佐剂系统[75μg BCG-CpG-DNA+0.2 mg A(lOH)3)]、15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2+03佐剂系统[(50μg PolyI:C+0.2 mg A(lOH)3]和15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2,NS组注射生理盐水。隔周免疫1次,共5次,于初次免疫2周后每周内眦采血,分离血清,采用ELISA法检测血清IgG值及抗体效价;于2、3、4、5次免疫后2周,无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用ELISPOT法,对分泌IFNγ、IL-2、IL-4的特异性淋巴细胞数量进行检测。结果 02佐剂组小鼠血清IgG抗体效价在2次免疫后2周即可达到1∶105,03佐剂组在3次免疫后1周达到1∶105,而Pr组在5次免疫后2周达到1∶105,4次免疫后02、03佐剂组达到最高值。分泌IL-4的特异性淋巴细胞数,03佐剂组均明显高于02佐剂组、Pr组及NS组,02佐剂组3、4、5次免疫后才明显高于NS组,5次免疫后才明显高于Pr组(P均<0.05);分泌IL-2的特异性淋巴细胞数,02佐剂组与03佐剂组比较差异无统计学意义(P>0.05),3次免疫后02、03佐剂组均明显高于NS组,且03佐剂组也明显高于Pr组,4次免疫后02、03佐剂组、Pr组均明显高于NS组(P均<0.05),但三者之间差异无统计学意义(P>0.05);分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数,02、03佐剂组、Pr组间差异无统计学意义(P>0.05),且03佐剂组在3次免疫后明显高于NS组,而02佐剂组、Pr组在5次免疫后才明显高于NS组(P均<0.05);02、03佐剂组分别在3、5次免疫后分泌IL-4的特异性淋巴细胞数量达到最高,且分别在5、3次免疫后,分泌IL-2的特异性淋巴细胞数量达到最高,二者均需5次免疫后分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数量才可达到最高。结论 03佐剂系统可更加有效地增强重组疟疾蛋白疫苗的免疫原性,诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,5次免疫后可达到最佳免疫效果。
2014年02期 v.27 156-162页 [查看摘要][在线阅读][下载 774K] [下载次数：165 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 陈俊英;潘玥;吉玛;张云昆;朱云;朱艳菊;邵聪文;马绍辉;
目的分析2009年昆明市病毒性脑炎患儿粪便中分离获得的埃可病毒30型(Echovirus30,Echo30)分离株A363/KM/2009全长VP1基因序列特征。方法从疑似病毒性脑膜炎患儿粪便样本中分离Echo30,提取病毒RNA,采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序。采用NCBI BLAST软件对所测定的序列进行数据库比对;采用Geneious软件对Echo30分离株全长VP1基因的核苷酸及氨基酸同源性进行分析;采用Mega 5.1软件对A363/KM/2009分离株进行VP1基因分析,并与20个参考株的VP1序列进行比较。结果分离株为A363/KM/2009,其VP1基因的核苷酸长度与其他Echo30一致,均为867 bp;与其他Echo30分离株核苷酸同源性在76.9%~95.7%之间,氨基酸同源性在88.7%~99.7%之间;与中国株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为84.5%~95.7%和96.9%~99.7%,其中与中国浙江分离株Echo30/zhejiang/10/4的同源性最高,为95.7%;与广西分离株GX10/15的同源性最低,为84.5%。氨基酸序列分析显示,与其他中国株包括脑脊液分离株相比,未见特异的突变位点;与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为76.9%~86.3%和88.7%~97.3%;基因进化树分析显示,与其他中国株分属不同的两个分支,而与Echo30/zhejiang/10/4和Echo30/zhejiang/4/04(CSF)株亲缘关系较近。结论 A363/KM/2009分离株为肠道病毒Echo30,属于中国两个分支中的一支。
2014年02期 v.27 163-167页 [查看摘要][在线阅读][下载 1040K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 赵达;王鹤;梁宏儒;胡旭;姜东君;高佳滨;尹辉;陈为宏;乔波;朱战波;
目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。
2014年02期 v.27 168-171+176页 [查看摘要][在线阅读][下载 888K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 吴迪;金戈;刘钊;张亮;黄荣忠;杨德雨;谢鹏;
目的原核表达人内源性博尔纳样核蛋白-1(endogenous Borna-like N element-1,EBLN-1),并进行纯化及鉴定。方法以人工合成的EBLN-1基因为模板,PCR扩增EBLN-1基因,克隆至载体pET-41a中,构建重组表达质粒pET-41aEBLN-1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta中,分别于18℃和37℃下进行IPTG诱导表达。采用包涵体稀释复性法对表达蛋白进行复性,经His亲和层析纯化后,SDS-GAGE和Western blot法鉴定纯化产物。结果重组表达质粒pET-41a-EBLN-1经菌落PCR及测序鉴定构建正确。重组表达蛋白相对分子质量约48 000,以包涵体形式表达。在大肠埃希菌Rosetta中37℃诱导时表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上,纯化后蛋白纯度可达90%,可与HRP标记的His探针特异性结合。结论成功表达并纯化了重组EBLN-1蛋白,为后续深入研究EBLN-1在人体中的生理作用及其与精神疾病的相关性奠定了基础。
2014年02期 v.27 172-176页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 戴素萍;潘玥;邵聪文;吉玛;朱艳菊;张云昆;朱云;马绍辉;
目的分析2011年昆明市手足口病患儿粪便中分离获得的人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)A22型分离株KM4/2011全长VP1基因的遗传特征。方法采用KMB17细胞对手足口病患儿粪便样本中筛查出的1株HRV样品进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序,采用BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Geneious basic 5.6.5软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega 5.05软件将HRV A22及部分HRV A、B和C群全长VP1基因构建系统进化树。结果分离株为KM4/2011,经扩增、测序和序列拼接获得长度为867 bp的VP1基因;KM4/2011株与其他HRV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为48.1%~91.0%和38.2%~97.6%,其中与HRV A22分离株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为90.8%~91.0%和97.3%~97.6%;基因进化树分析显示,KM4/2011株与HRV A22基因型属于同一个进化分枝。结论 KM4/2011分离株为HRV A22型,存在地域差异。
2014年02期 v.27 177-179+184页 [查看摘要][在线阅读][下载 870K] [下载次数：186 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨妍梅;冯若飞;谢晶莹;李向茸;王丹;马忠仁;
目的建立无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,并检测其生物学特性。方法将CHO-K1贴壁细胞通过逐步降低血清浓度,获得低血清CHO-K1贴壁细胞,以3×105个/ml接种于含无血清培养基SFM4CHO的150 ml三角瓶中,摇床无血清适应培养,获得CHO-K1-SFS细胞。对该细胞进行生长曲线绘制、微生物污染检测、代谢分析及外源基因表达检测。结果所获得的CHO-K1-SFS细胞系可无血清悬浮培养,以3×105个/ml的初始密度接种,最大增殖浓度可达3.8×106个/ml,平均倍增时间为29.7 h;无细菌、真菌、病毒和支原体污染;对葡萄糖利用率较高,乳酸产生较多;能较好地表达外源基因。结论成功建立了无血清悬浮培养CHO-K1-SFS细胞系,为建立高效的外源基因表达平台奠定了基础。
2014年02期 v.27 180-184页 [查看摘要][在线阅读][下载 925K] [下载次数：863 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 程龙飞;陈红梅;傅光华;施少华;万春和;傅秋玲;黄瑜;林建生;
目的分析11型鸭疫里默菌(Riemerella anatipestifer,RA)的药物敏感性、致病性及其免疫保护力。方法纸片扩散法检测73株11型RA分离株的药物敏感性;将2×108和2×107CFU/ml的RA菌株悬浮液分别经皮下注射10羽10日龄的樱桃谷鸭,0.5 ml/羽,攻菌后连续观察5 d,记录死亡数,并从死亡鸭肝脏中分离细菌,计算死亡率;用分离的菌株RA1229制备灭活油乳剂疫苗,分别经皮下注射50羽7日龄樱桃谷鸭,0.3 ml/羽,14 d后,各组樱桃谷鸭均经皮下注射RAf74、RA234、RA1067、RA1156和RA1229的新鲜培养液(含菌量为2×107CFU/ml),0.5 ml/羽,攻菌后连续观察5 d,记录死亡数,并从死亡鸭肝脏中分离细菌,计算死亡率。结果 90%以上菌株敏感的药物有头孢唑啉、氟苯尼考和头孢氨苄,其他敏感药物依次为阿莫西林、氨苄西林、强力霉素、壮观霉素、丁胺卡那霉素和利福平;死亡鸭肝脏分离株中有10株的致病性相似,注射1×108及1×107CFU/ml RA的樱桃谷鸭死亡率分别为100%及80%,RA1229的致病性略强;RA1229制备的疫苗对樱桃谷鸭的保护率高于90%。结论 11型RA对多种抗生素敏感,有较强的致病性,RA1229具有良好的免疫保护力,可作为制备RA灭活疫苗的候选菌株。
2014年02期 v.27 185-188页 [查看摘要][在线阅读][下载 934K] [下载次数：84 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 宋涛;刘跃亮;赵艳芳;王文娟;徐静;罗进勇;
目的探讨cAMP-PKA-CREB信号通路在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法将C3H10T1/2细胞分别加入不同浓度的cAMP-PKA-CREB信号通路抑制剂H89(1、2.5、5和10μmol/L),检测其对碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响;通过ALP定量和钙盐沉积试验分别检测H89对BMP9诱导C3H10T1/2细胞早期和晚期成骨分化的影响;经Western blot法检测H89对C3H10T1/2细胞中磷酸化CREB、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和成骨关键转录因子Runx2表达水平的影响;通过Wentern blot及荧光素酶活性的检测,观察H89对经典信号通路BMPs-smad1/5/8的影响。结果随着H89浓度的增加,对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP的抑制作用明显增强(P<0.05),且呈剂量依赖性;ALP定量和钙盐沉积试验结果表明,H89可明显抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞早期及晚期成骨分化;H89可显著抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中磷酸化CREB、OCN及Runx2蛋白的表达(P<0.05),与AdBMP9组比较,H89对经典BMPs-smad1/5/8信号通路无明显影响(P>0.05)。结论阻断cAMP-PKA-CREB信号通路可抑制BMP9诱导的MSCs C3H10T1/2的成骨分化,为BMP9的临床应用奠定了理论基础。
2014年02期 v.27 189-193+196页 [查看摘要][在线阅读][下载 1146K] [下载次数：565 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 张梅;曾艳;周丽;黄文宇;
目的观察符合热原试验要求的不同体温的家兔,在注射人血白蛋白后的升温情况。方法按照《中国药典》三部(2005版)中的"热原检查法"进行测定。试验分为2组:A组家兔体温在38.0~39.6℃之间;B组家兔体温在38.5~39.6℃之间。每批供试品(人血白蛋白)初试时使用3只家兔,复试时使用5只家兔。均经家兔耳缘静脉缓慢注入预热的供试品,0.6 g/kg,每隔30 min测量1次体温,连续6次。结果 A组供试品初试时的合格率(80.77%)与复试时的合格率(53.84%)差异有统计学意义(P<0.05);B组供试品初试时的合格率(96.15%)与复试时的合格率(92.31%)差异无统计学意义(P>0.05)。A组供试品有15批结果相同,重复率为57.69%,B组供试品有25批结果相同,重复率为96.15%,两组检测结果的重复性差异有统计学意义(P<0.005)。A组升温≥0.6℃家兔所占比例明显高于B组,差异有统计学意义(P<0.005)。结论家兔对热原的敏感性随体温的高低有明显的差异,体温偏低的家兔对热原更敏感,其升温幅度大于体温偏高的家兔。
2014年02期 v.27 194-196页 [查看摘要][在线阅读][下载 995K] [下载次数：244 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 陈雄;吴小候;罗春丽;张龙;石军辉;陶佳;
目的探讨干扰素γ(interferonγ,IFNγ)对人肾癌786-0细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法用不同浓度(1 000、2 000、3 000、4 000和5 000 U/ml)的IFNγ作用人肾癌786-0细胞不同时间,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;将786-0细胞分为试验组(加入900 U/ml IFNγ)和细胞对照组(未作任何处理),作用48 h后,流式细胞术检测786-0细胞细胞周期的分布,RT-PCR法检测细胞中肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞中有丝分裂抑制缺陷蛋白1(mitotic arrest deficiency 1,MAD1)的表达水平;将腺病毒质粒hepaCAM及空腺病毒质粒瞬时转染786-0细胞,Western blot检测细胞中hepaCAM及MAD1蛋白的表达水平。结果 IFNγ可抑制786-0细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性(P<0.05);与细胞对照组相比,试验组细胞G1期细胞比例、hepaCAM基因mRNA的转录水平及MAD1蛋白的表达水平均明显升高(P均<0.01);转染腺病毒质粒的786-0细胞中hepaCAM和MAD1蛋白的表达水平明显高于空腺病毒质粒组及空白对照组(P<0.05)。结论 IFNγ可能通过hepaCAM-MAD1途径使细胞周期阻滞于G1期,从而抑制肾癌786-0细胞增殖,本实验为进一步研究肾癌的发生发展机制及有效治疗途径奠定了基础。
2014年02期 v.27 197-201+206页 [查看摘要][在线阅读][下载 1094K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张凤香;贺成业;李晨光;郭闻师;
目的探讨大蒜素(allicin)对人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖活力及迁移能力的影响。方法提取健康成人EPCs,经DiI-acLDL和FITC-UEA-I染色后,于激光共聚焦显微镜下观察染色结果;向EPCs加入5、10、15和20μg/ml的大蒜素,分别作用12、24、48和72 h,MTT法检测各组EPCs的增殖活力;Transwell小室试验及Western blot法分别检测大蒜素作用48 h后,其对各组EPCs迁移能力及EPCs中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质细胞衍生因子-1(stromal cells derived factor-1,SDF-1)蛋白表达水平的影响。结果 DiI-acLDL染色可见绿色荧光,FITC-UEA-I染色可见红色荧光,双重染色可见黄色荧光。作用12、24和48 h的10、15和20μg/ml大蒜素组EPCs的增殖活力显著高于空白对照组(P<0.05),且呈浓度依赖性,于48 h时达最高;10、15和20μg/ml大蒜素组EPCs的迁移能力及EPCs中VEGF和SDF-1蛋白的表达水平均明显高于空白对照组(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论大蒜素可提高人EPCs的增殖活力及迁移能力,该作用可能是通过调节VEGF和SDF-1的表达而实现的,为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的防治提供了新的思路。
2014年02期 v.27 202-206页 [查看摘要][在线阅读][下载 1125K] [下载次数：216 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 杨秀丽;邓宗勇;李平华;
目的探讨二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)对损伤后大鼠视网膜神经节细胞-5(retinal ganglion cell-5,RGC-5)神经突起再生及RhoA和神经突蛋白(neuritin)表达的影响。方法 RGC-5经十字孢碱诱导分化后,将细胞分为正常对照组、模型组[用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)制备大鼠RGC-5神经突起氧糖剥夺/复氧损伤模型]和DHT干预组(终浓度分别为1、10、100 nmol/L),采用MTT比色法测定各组细胞的存活率;显微镜下观察神经突起长度和数量;RT-PCR和Western blot法分别检测RGC-5中RhoA和Neuritin基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平。结果与模型组比较,10和100 nmol/L DHT干预组及正常对照组的细胞存活率和神经突起数量均明显上升(P均<0.05);1、10和100 nmol/L DHT干预组及正常对照组的神经突起长度、Neuritin基因mRNA转录水平和蛋白表达量均明显增加(P均<0.05),RhoA基因mRNA转录水平及蛋白表达量均明显减少(P均<0.05)。结论 RhoA和Neuritin可能是影响RGC-5神经突起再生的重要因子,DHT可能通过调节RhoA和Neuritin的表达,从而发挥神经保护作用。
2014年02期 v.27 207-211页 [查看摘要][在线阅读][下载 1155K] [下载次数：116 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 罗兰;徐兴华;黄文静;李卫平;孙文娟;
目的探讨氨氯地平(amlodipine)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)联合用药对小鼠肝癌H22细胞的抑制作用。方法经不同终浓度的氨氯地平(3.125、6.25、12.25、25和50μmol/L)及不同终浓度的5-Fu(12.5、25、50、100和200μg/ml)单独及联合作用小鼠肝癌H22细胞,24、48、72 h后,采用MTT法检测药物对H22细胞生长的抑制作用;流式细胞术及免疫细胞化学法分别检测药物作用48 h后对H22细胞凋亡及细胞中Bcl-2、Bax表达水平的影响。将H22细胞(1.0×107个/ml)经小鼠右腋皮下注射,0.2 ml/只,于注射第2天,将小鼠分为空白对照组(经腹腔注射0.9%生理盐水,0.2 ml/d)、氨氯地平组[用氨氯地平片剂灌胃,10 mg/(0.1 ml·10 g体重·d)]、5-Fu组[分别于接种后第3、6、9天,经腹腔注射5-Fu溶液,10 mg/(1 ml·10 g体重·d)]及联合用药组(氨氯地平及5-Fu的给药方式与剂量同氨氯地平组及5-Fu组),每组10只(雌雄各半),连续给药10 d,次日断颈处死小鼠,称瘤重,并计算肿瘤生长抑制率。结果氨氯地平组、5-Fu组及联合用药组的细胞生长抑制率均随药物浓度增加逐渐上升,且呈剂量-时间依赖性。联合用药组与氨氯地平组及5-Fu组比较,H22细胞的凋亡率明显升高(P<0.05);Bcl-2表达水平明显降低,Bax的表达水平明显升高(P<0.05);小鼠体内瘤重明显降低(P<0.001),肿瘤生长抑制率明显升高(P<0.01)。结论氨氯地平与5-Fu联合用药对体内H22细胞的抑制作用明显强于各单独用药组,具有协同作用,为氨氯地平作为一种化疗增敏剂用于肿瘤的临床治疗提供了实验依据。
2014年02期 v.27 212-216+220页 [查看摘要][在线阅读][下载 1242K] [下载次数：321 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 沈克飞;杨睿;徐登峰;付利芝;葛良鹏;王孝友;
目的探讨富含Trp/Arg六肽对糖尿病小鼠皮肤创伤愈合的影响。方法经小鼠腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病模型,在糖尿病小鼠背部切取直径8 mm的圆形全层皮肤,形成皮肤损伤模型。将皮肤损伤模型小鼠随机分为富含Trp/Arg六肽RRWWCR、RRWWFR、RRWWTR组和生理盐水组,分别在创伤形成同时,在伤口处擦拭0.1 mg/ml相应药物,每只0.2 ml,开放式治疗10 d,每天1次。每天观察创面形态变化,并测量创面直径;每5 d取附带周围正常组织的创面全层皮肤,进行组织病理学观察。结果 RRWWCR和RRWWTR可促进创面组织的修复,表现为加强早期炎症反应、促进新生血管、肉芽组织和再上皮化形成以及缩短创面愈合时间。结论富含Trp/Arg六肽对糖尿病小鼠皮肤创伤愈合具有促进作用,其第5位氨基酸残基极性可极大地影响其促修复能力。
2014年02期 v.27 217-220页 [查看摘要][在线阅读][下载 1163K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]
- 陈晓虹;吴建国;曹传平;唐亮;曾贤;范佳君;李玉彬;赵丽丽;刘增田;程凡亮;张继环;马连明;宋华;白文;鞠佃文;
目的比较不同型号Protein A填料的性能,筛选合适的Protein A填料,用于大规模单克隆抗体(简称单抗)纯化。方法采用表达H02单抗的CHO细胞培养上清,测试不同供应商Protein A填料的蛋白结合载量,选择合适的填料,用于大规模单抗纯化;检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、外源DNA及Protein A残留量,以评价其纯化效果;检测Protein A柱在位清洗(cleaning in place,CIP)效果,并验证其循环使用次数。结果 Amsphere Protein A JWT203填料为合适的ProteinA填料,H02单抗大规模纯化后,可有效去除HCP、DNA及脱落Protein A;采用0.1 mol/L NaOH进行CIP,经过300个循环,对H02单抗仍保持80%以上动态结合载量,Protein A脱落无明显增加,对HCP、外源DNA、聚合体的去除能力无明显改变,层析图谱与初始基本一致,Amsphere Protein A JWT203填料的理化性质较稳定。结论 AmsphereProtein A JWT203是一种可用于大规模单抗纯化的新型Protein A填料。
2014年02期 v.27 228-234页 [查看摘要][在线阅读][下载 1385K] [下载次数：731 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 霍立红;乐伟;史权威;李曼;何景昌;刘荷中;
目的筛选神经生长因子(nerve growth factor,NGF)依赖的TF-1亚克隆细胞株,用于重组人NGF(rhNGF)生物学活性的测定。方法逐步将含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophagecolony stimulating factor,rhGM-CSF)的培养基替换为含鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,mNGF)的培养基,将rhGM-CSF依赖的TF-1细胞驯化为mNGF依赖的TF-1细胞;绘制mNGF依赖的TF-1细胞的剂量-效应反应曲线,计算信噪比(S/N)和细胞最大效应(maximal effect,Emax)区间;用甲基纤维素半固体培养基对mNGF依赖的TF-1细胞进行克隆化,镜下挑选单克隆细胞,扩大培养,绘制各单克隆细胞株对NGF的剂量-效应反应曲线,并对其中反应性最好的单克隆细胞株进行STR图谱鉴定;对细胞接种密度和培养时间进行优化;用筛选出的细胞检测rhNGF的生物学活性。结果经驯化,rhGM-CSF依赖的TF-1细胞可在只含mNGF的培养基中正常生长,并对NGF的刺激呈良好的剂量-效应反应关系;驯化后的mNGF依赖的TF-1细胞对mNGF的剂量-效应曲线的信噪比为2.0,Emax为0.43;共筛选出15株细胞形态良好、倍增时间稳定的单克隆细胞株,其中A2亚克隆细胞株(TF-1-A2)反应性最好;该细胞中未发现人类细胞交叉污染现象,仅在CSF1PO位点与ATCC TF-1细胞数据有差异,可判定为TF-1细胞;细胞接种密度为5×104个/ml、培养时间为72 h时对rhNGF有良好的反应性,可用于rhNGF生物学活性的检测。结论成功筛选出1株对NGF具有良好反应性的TF-1-A2亚克隆细胞株,可用于定量检测NGF的生物学活性。
2014年02期 v.27 235-240+244页 [查看摘要][在线阅读][下载 1436K] [下载次数：233 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王淑菁;付瑞;巩薇;王吉;卫礼;李晓波;贺争鸣;岳秉飞;
目的对重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺进行验证。方法以脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,考察重组融合蛋白生产中柱层析步骤(染料亲和层析、阴离子交换层析和凝胶层析)去除病毒的效果。结果经染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析后,EMCV滴度降低平均值分别为1.968、1.984和4.391 log10,3步柱层析共去除EMCV 8.343 log10;PPV滴度降低平均值分别为2.135、3.936和2.048 log10,3步柱层析共去除PPV 8.119 log10。结论染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析3步柱层析联合处理,在生产过程中可有效去除指示病毒(EMCV和PPV)及其所代表的相关病毒。
2014年02期 v.27 241-244页 [查看摘要][在线阅读][下载 1243K] [下载次数：325 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张琨;张月娟;万一;王增禄;
目的优化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化重组人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)改构体(rmhCu,Zn-SOD)的制备工艺,以期延长其在体内的半衰期。方法以相对分子质量5 000的甲氧基聚乙二醇乙酸-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)作为修饰剂,对rmhCu,Zn-SOD蛋白进行化学修饰,并对mPEG-SPA与rmhCu,Zn-SOD的摩尔比、反应缓冲液、反应温度、反应方式及反应时间进行优化;利用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法对PEG化rmhCu,Zn-SOD进行分离纯化,并检测其在小鼠体内的半衰期。结果 PEG化rmhCu,Zn-SOD的最佳制备工艺为mPEG-SPA与rmhCu,Zn-SOD的摩尔比1.5∶1,缓冲液为pH 8.5的磷酸盐缓冲液,反应液混匀后4℃静置反应1 h;纯化的修饰产物的纯度约为90%,残余酶活力为(84.3±2.3)%,蛋白修饰率为(65.4±1.9)%;与未修饰的rmhCu,Zn-SOD相比,PEG化rmhCu,Zn-SOD的半衰期延长了约7倍。结论优化了PEG化rmhCu,Zn-SOD的制备工艺;PEG化修饰有效延长了该改构体蛋白在体内的半衰期。
2014年02期 v.27 245-250页 [查看摘要][在线阅读][下载 1370K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘莉莎;范慧红;
目的采用两步水解及反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)分离测定疫苗中聚肌胞(polyinosinic-cytidylic acid,PIC)成分。方法对经蛋白酶K消化、饱和酚抽提、乙醇沉淀回收的含有PIC成分的狂犬病疫苗样品采用KOH碱水解及碱性磷酸酶水解2、6、10 h后,采用RP-HPLC法检测疫苗中的PIC成分,色谱条件:色谱柱Xtimate HPLC Column(C18,4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙酸铵溶液-甲醇(96∶4),流速:0.8 ml/min;紫外检测波长:254 nm;柱温:25℃;进样量:5μl。结果 PIC经碱性磷酸酶不同时间水解,确定最佳水解时间为6 h;疫苗中的PIC成分被成功分离成肌苷峰和胞苷峰,且分离度良好。结论两步水解及RP-HPLC法可成功分离出疫苗中的PIC成分,为疫苗的质量控制及监管提供参考。
2014年02期 v.27 251-253页 [查看摘要][在线阅读][下载 1248K] [下载次数：166 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 张梦;蓝晖翔;伍雅婷;张艳红;吕斌;
目的采用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术快速检测痕量牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)含量。方法将兔抗BSA抗体标记到表面等离子共振芯片表面,监测BSA与抗体结合后SPR芯片表面的变化,利用SPR技术建立快速检测痕量BSA的新方法,对建立的方法进行检出限、定量限和最佳线性范围的确定,并进行重复性验证及初步应用。结果抗体的标记水平为10 000 RU,对BSA具有良好的亲和能力;基于信噪比为3时,BSA的检出限为0.003 ng/ml,基于信噪比为10时,BSA的定量限为0.01 ng/ml,BSA浓度在0.01~100 ng/ml范围内,与SPR仪响应值的变化量呈良好的线性关系,R2=0.997 9;用建立的SPR方法检测不同浓度BSA的日内RSD为3.3%~4.6%,日间RSD为3.4%~4.8%,均小于5%;SPR方法和间接竞争酶联免疫测定法(indirect competitive ELISA,icELISA)检测不同浓度BSA含量的结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论已建立了采用SPR技术检测BSA的新方法,可用于痕量BSA的快速检测。
2014年02期 v.27 254-256+261页 [查看摘要][在线阅读][下载 1279K] [下载次数：299 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 张莉;刘志;刘晓凤;唐朝辉;杨国友;许敬敏;秦敏;
目的建立氨水法制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法,并进行验证。方法参照《欧洲药典》中氢氧化铝佐剂吸附能力检测方法的原理,将氨水法制备的氢氧化铝佐剂分别以0.25~1 mg/ml 6个最终铝浓度,吸附0.5~10 mg/ml 7个浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液,根据吸附效果,筛选最佳吸附铝浓度和适合的BSA溶液浓度,建立氨水法制备的氢氧化铝佐剂吸附能力检测方法,并验证该方法的准确度、重复性和中间精密性。结果在最终铝浓度为0.3 mg/ml时,可完全吸附3个低浓度蛋白,3个高浓度蛋白呈较好的浓度梯度,符合《欧洲药典》要求。经验证,该方法检测氨水法配制的氢氧化铝佐剂的吸附能力准确度、重复性和中间精密性良好。结论建立了氨水法制备的氢氧化铝佐剂吸附能力的检测方法,为氢氧化铝佐剂相关质量标准的建立奠定了基础。
2014年02期 v.27 257-261页 [查看摘要][在线阅读][下载 1315K] [下载次数：511 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 龚燕燕;殷欣;唐存多;邬敏辰;曾妍;
目的利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同降解小麦麸皮,制备阿魏酸(ferulic acid,FA)。方法将工程酵母菌P.pastoris GS115/AusfaeA和GS115/Ausxyn11A经甲醇诱导发酵,分别获得重组阿魏酸酯酶和木聚糖酶。在pH 5.0、40℃、料液比1∶60(g∶ml)、水解10 h的条件下,探讨木聚糖酶添加量、阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用对阿魏酸酯酶水解去淀粉麦麸(destarched wheat bran,DSWB),释放FA的影响,并检测酶解产物FA的体外抗氧化活性。结果在0.5g DSWB中单独加入56U阿魏酸酯酶时,FA的释放率为碱提等量麸皮总FA含量的19.48%;在此基础上添加木聚糖酶,能促进阿魏酸酯酶进一步释放FA,当木聚糖酶添加量为300 U时,FA的释放率从19.48%上升至70.10%;木聚糖酶单独作用于DSWB未检测到FA的释放;在反应体系中先添加木聚糖酶,能释放1.23 mg FA,比先添加阿魏酸酯酶提高了0.3 mg;随着FA浓度的增加,FA的还原能力及其对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力均呈稳定增长,各浓度FA对羟基自由基的清除能力均高于对DPPH自由基的清除能力。结论阿魏酸酯酶与木聚糖酶之间存在协同作用,双酶共同作用,有利于小麦麸皮的降解,提高FA的释放率。
2014年02期 v.27 262-266页 [查看摘要][在线阅读][下载 1429K] [下载次数：384 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：0 ] - 李勇飞;马鸣潇;宋英今;李银平;
目的建立中蜂囊状幼虫病病毒(chinese sacbrood,CSBV)依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplific ation,HDA)检测方法,并对该方法进行优化及验证。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫RNA,以其为模板进行HDA,对建立的HDA的引物浓度(原始浓度为50μmol/L,进行10、20、40、80、160、240、320倍稀释)、反应温度(60、65及70℃)及时间(60、90及120 min)进行优化,并对优化的方法进行特异性、敏感性及稳定性验证。经电镜观察、RT-PCR及优化的HDA法对37份临床样品进行检测。结果 HDA最佳引物浓度、反应温度及时间分别为5μmol/L、65℃及90 min;CSBV与健康幼虫、蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus,ABPV)、蜜蜂慢性麻痹病毒(chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(black queen cell virus,BQCV)和残翅病毒(deformed wing virus,DWV)cDNA均无交叉反应,HDA的最低检出限为10-2ng,检测试剂保存12个月后,仍可扩增出目的条带;37份临床样品中,有6份样品的RT-PCR和HDA结果为阳性,但电镜观察仅有4份为阳性。结论建立了CSBV HDA检测方法,该方法具有较高的敏感性、特异性及稳定性,为检测其他蜂病毒及快速鉴定其他动物病毒提供了参考。
2014年02期 v.27 267-271页 [查看摘要][在线阅读][下载 1432K] [下载次数：190 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ]