- 王奔;王宁;周思杭;李静;佟雪莲;唐玉龙;王玉琳;
目的原核表达、纯化苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)包膜糖蛋白GP64胞外区,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的AcMNPV GP64基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除GP64基因信号肽和跨膜区的引物,PCR扩增GP64胞外区基因,插入原核表达载体pET-21b(+)中,转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF crude纯化后,进行SDS-PAGE和Wester blot分析。将纯化的重组蛋白经背部皮下免疫家兔,制备多克隆抗体,采用免疫染色法检测多克隆抗体对AcMNPV的中和作用。结果重组表达质粒pET-21b(+)-GP64经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 000,表达量占菌体总蛋白的46.8%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上,可与鼠抗AcMNPV GP64蛋白单克隆抗体特异性结合;制备的兔抗GP64蛋白多克隆抗体能与纯化的重组蛋白和杆状病毒发生特异性反应,抗体效价高于1∶1 000 000,其可中和100 TCID50/ml的AcMNPV,使AcMNPV无法感染昆虫细胞Sf9,中和效价为1∶8。结论成功原核表达了AcMNPV GP64蛋白胞外区,并制备了对AcMNPV有完全中和能力的多克隆抗体,为昆虫细胞/杆状病毒表达系统的应用研究及杆状病毒毒株的检定等提供了材料。
2013年09期 v.26 1209-1213页 [查看摘要][在线阅读][下载 423K] [下载次数：322 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张明义;黄岚;李泽锋;郭美锦;周华;
目的表达能够与肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)结合的低相对分子质量重组小肿瘤坏死因子α拮抗剂(small TNFαantagonist,STNFαA),并对纯化后蛋白的生物学活性进行检测。方法利用计算机模拟优化设计出与TNFR1具有较高结合力的STNFαA氨基酸序列,根据大肠埃希菌"密码偏爱性"设计合成目的基因,插入质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-STNFαA,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni Sepharose 6 Fast Flow层析介质进行亲和纯化,纯化产物经SDSPAGE、HPLC分析;采用MTT法检测重组蛋白的生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;重组蛋白STNFαA相对分子质量约17 000,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在,纯度大于95%;重组蛋白STNFαA对TNFα的抑制作用呈浓度依赖性。结论已成功表达了STNFαA,该蛋白具有抑制TNFα介导的细胞毒生物活性作用,为全新的TNF拮抗剂的新药研究奠定了基础。
2013年09期 v.26 1214-1217页 [查看摘要][在线阅读][下载 235K] [下载次数：74 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 亢渝俊;王川;姜政;王丕龙;
目的构建人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达。方法采用巢式PCR法从人结肠癌SW-480细胞中扩增EMMPRIN基因,插入pEGFP-N1质粒,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,转染COS-7细胞,48 h后,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法和Western blot法分别检测转染细胞中EMMPRIN基因mRNA的转录和蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pEGFP-N1-EMMPRIN经菌落PCR、酶切及测序证实构建正确,测序结果经比对分析,仅发现1个碱基突变,即534位:GCC→GCT,为无义突变;pEGFP-N1-EMMPRIN转染的COS-7细胞能表达绿色荧光蛋白,且能检测到EMMPRIN基因mRNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了人EMMPRIN真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达了EMMPRIN,为进一步研究EMMPRIN在恶性肿瘤发生发展中的作用及其基因治疗奠定了基础。
2013年09期 v.26 1218-1221+1227页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] [下载次数：76 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 付小哲;方翔;李宁求;林强;潘厚军;石存斌;黄志斌;吴淑勤;
目的克隆鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,并进行生物信息学分析。方法根据已发表的细菌ompA序列,通过比对保守区域(88~107 bp,988~1 007 bp)设计简并引物,通过PCR技术从鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株扩增ompA基因核心序列,采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法扩增ompA基因全长及其上下游序列;应用Vector NTI 9.0对ompA序列进行拼接,应用Vector NTI 9.0、SignalP 3.0对OmpA蛋白的基本参数、信号肽等进行预测分析;通过Blastn分析嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因序列与其他菌种ompA序列的同源性,并构建系统进化树及对其蛋白的三维结构进行分析。结果ompA基因全长为2 004 bp,其中包括ORF 1 059 bp,编码352个氨基酸,5′端侧翼序列271 bp,3′端侧翼序列574 bp;OmpA蛋白相对分子质量约37 900,等电点为4.94,OmpA蛋白序列N-末端的前20个氨基酸残基为信号肽序列;根据22种细菌的OmpA蛋白序列构建的系统进化树显示,嗜水气单胞菌GYK1株与嗜水气单胞菌SSU株的亲源关系最近,相似性达95.5%;三维结构分析表明,OmpA蛋白N-末端功能区是由8个反向平行的β-折叠片构成的β-折叠桶;OmpA蛋白Asn25~Ala205片段4个环区的平均柔性显著高于其余部位的柔性。结论成功克隆了鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株ompA基因,并对OmpA蛋白的相关生物信息学进行了分析,为嗜水气单胞菌呈递外源蛋白基因工程疫苗的研究奠定了基础。
2013年09期 v.26 1222-1227页 [查看摘要][在线阅读][下载 445K] [下载次数：338 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 聂佳莹;杨致邦;唐磊;黄进;蒋英;
目的原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感应蛋白CrdS,并对其进行生物信息学分析,以探讨其酸适应的调控机制。方法从H.pylori 26695标准株全基因组DNA中PCR扩增编码CrdS蛋白的基因hp1364,插入原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hp1364,转化大肠埃希菌(E.coli)XL1-blue,IPTG诱导表达重组CrdS蛋白。表达的重组蛋白经Western blot鉴定后,进行生物信息学分析。结果重组表达质粒pQE30-hp1364经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为46 000,表达量占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式存在,可与Rabbit anti His-Tag Polyclonal Antibody特异性结合;生物信息学分析显示,CrdS的核苷酸序列和氨基酸序列与其他H.pylori菌株(HpG27、F30、B38)具有高度同源性,表面有许多亲水性区域,含多种易被磷酸化的氨基酸。结论成功原核表达了H.pylori CrdS蛋白,并进行了生物信息学分析,为进一步探讨CrdS的感应机制及通过阻断信号感应抗H.pylori感染的途径提供了实验材料。
2013年09期 v.26 1228-1231+1236页 [查看摘要][在线阅读][下载 357K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 任玉莹;程海;王维龙;吴晓芳;史洪娜;陈丹;李鼎锋;刘勇;王立良;
目的在杆状病毒表达系统中表达心肌钙蛋白(Icardiac troponin I,cTnI)。方法将带有6×His标签的cTnI基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac-dua(lpFBd)中,构建重组转移质粒pFBd-cTnI,转化大肠埃希菌DH10-Bac,筛选获得重组杆粒rbacmid-cTnI,转染昆虫细胞Sf9,SDS-PAGE和Western blot检测转染细胞中cTnI蛋白的表达。结果重组杆粒rbacmid-cTnI经PCR鉴定证明构建正确;重组杆粒rbacmid-cTnI转染的Sf9细胞(Invitrogen细胞株)可表达相对分子质量约25 000的cTnI蛋白条带,表达的cTnI蛋白可被鼠抗His标签单抗和兔抗cTnI多抗特异性识别。结论成功在Sf9细胞中表达了cTnI蛋白,为下一步大规模制备cTnI蛋白以及建立cTnI相关检测方法奠定了基础。
2013年09期 v.26 1232-1236页 [查看摘要][在线阅读][下载 318K] [下载次数：87 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 胡敏;宋培培;湛晓琴;吕自兰;章帆;翁亚光;
目的探讨骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对食管鳞状细胞癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及细胞周期的影响。方法用AdGFP和AdBMP9分别感染3株食管鳞状细胞癌细胞株ECA109、KYSE150和KYSE180,并设不感染病毒的3种细胞作为对照,采用RT-PCR法检测AdBMP9感染的3株细胞中BMP9基因mRNA的转录水平,MTT法检测病毒感染细胞0~96 h各组细胞的增殖活力,平板克隆法检测各组细胞的克隆形成能力,划痕试验检测各组细胞的迁移能力,Transwell小室试验检测各组细胞的侵袭能力,并对3组ECA109细胞进行细胞周期的检测。结果 AdBMP9感染的3株细胞中BMP9基因mRNA的转录水平均明显提高。与AdGFP感染和未感染病毒的细胞相比,3种细胞在过表达BMP9后,增殖活力明显降低(P<0.05);细胞克隆形成能力均下降(下降率达70%以上),且克隆细胞团明显变小;细胞迁移和侵袭能力均下降;AdBMP9感染的ECA109细胞处于G1期的细胞比例明显上升,S期比例明显下降(P<0.05)。结论 BMP9可明显抑制食管鳞癌细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭能力,并将细胞周期阻滞于G1期。
2013年09期 v.26 1237-1241页 [查看摘要][在线阅读][下载 463K] [下载次数：51 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 倪宏波;钱爱东;姜海芳;
目的原核表达边缘无浆体(Anaplasma marginale,A.marginale)MSP1α和MSP1β蛋白,并检测其对牛红细胞的黏附作用。方法通过PCR法扩增MSP1α和MSP1β基因,插入表达载体pGEX-6p-1中,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组MSP1α和MSP1β蛋白经透析法纯化后,分别免疫新西兰白兔和商品蛋鸡,制备免疫兔血清及抗MSP1α和MSP1βIgY抗体,Western blot法分析其免疫原性,间接免疫荧光法(immunofluorescence assay,IFA)检测其在大肠埃希菌外膜上的表达,血凝试验(hemagglutination test,HA)和血凝抑制试验(hemagglutination inhibition test,HI)检测其对牛红细胞的黏附作用。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β经PCR、双酶切及测序证实构建正确;表达的重组MSP1α和MSP1β蛋白相对分子质量分别约为58 000和107 000,主要以包涵体形式存在,表达量分别占菌体总蛋白的31%和14%;纯化的重组MSP1α和MSP1β蛋白纯度分别可达93%和91%,可与免疫兔血清发生反应;抗MSP1α和MSP1βIgY抗体可分别与表达MSP1α和MSP1β蛋白的重组菌发生反应;重组MSP1α和MSP1β蛋白对牛红细胞具有明显的黏附作用,吸附率可达56.4%和52.7%。结论MSP1α和MSP1β基因可在大肠埃希菌外膜上大量表达,并对牛红细胞具有明显的吸附作用,为进一步揭示牛边缘无浆体病的作用机理奠定了基础。
2013年09期 v.26 1242-1246+1250页 [查看摘要][在线阅读][下载 458K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘芳;李法琦;
目的构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒,并对其进行鉴定。方法根据GenBank登录的小鼠CX3CR1基因序列设计引物,PCR扩增CX3CR1基因,将其定向克隆至载体pUbi-MCS-EGFP,经菌落PCR和序列测定,将鉴定正确的重组慢病毒质粒转染293T细胞,显微镜下观察病毒的绿色荧光,并根据荧光表达情况计算转染病毒滴度。结果 CX3CR1基因PCR产物经琼脂凝胶电泳鉴定,可见约1 000 bp的目的条带;经菌落PCR鉴定及序列测定,重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP构建正确,转染293T细胞48 h后,可见绿色荧光表达,经计算,病毒滴度为2×108TU/ml。结论成功构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP,为研究慢病毒介导的CX3CR1基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)及其归巢能力奠定了基础。
2013年09期 v.26 1247-1250页 [查看摘要][在线阅读][下载 196K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 柏玉碧;张聪明;李媛;刘蓉丽;倪永碧;丁亚凌;吴强;
目的探讨酸性条件下血液制品中残留辛酸/根的急性毒性。方法配制辛酸浓度分别为0.25、2.5和10 mg/ml的10%静注人免疫球蛋白(pH 4)溶液,另设阴性对照组(0.9%NaCl),经尾静脉注射SD大鼠,每只大鼠等容量注射,注射剂量为4.5 ml/只。每天观察1次大鼠的形态外观、四肢活动和行为方式,并记录大鼠摄食量,共14 d;给药后第3、7、14天称量大鼠体重,计算体重增长率;给药后第14天解剖所有动物,观察内脏器官病变情况。结果辛酸浓度为10 mg/ml时,大鼠出现了明显的应激反应、血尿和行为特征的改变,体重增长率明显降低(P<0.01),解剖后发现有较明显的肺部病变;辛酸浓度为0.25和2.5 mg/ml时,未表现出明显的应激反应和行为特征异常,解剖观察均与阴性对照组无明显差异。结论 10%静注人免疫球蛋白(pH 4)溶液中辛酸/根浓度为2.5 mg/ml时不会对大鼠造成急性毒性,为酸性条件下血液制品中辛酸/根残留的安全性评价提供了实验数据,也为后期制定10%静注人免疫球蛋白(pH 4)中残留辛酸/根的限量标准提供了参考。
2013年09期 v.26 1251-1253+1257页 [查看摘要][在线阅读][下载 141K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴晓彬;麦力;张冀;马冬梅;刘革力;易发平;卜友泉;汪长东;宋方洲;
目的探讨MCPH1(microcephalin 1)基因过表达对人肺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1(实验组)和pcDNA3.1(-)(阴性对照组)分别转染人肺癌A549细胞,采用Real-time PCR及Western blot法分别检测转染48 h后的细胞内MCPH1的表达;采用细胞划痕试验及Transwell试验分别检测MCPH1过表达对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果实验组A549细胞中MCPH1水平明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均<0.05);实验组细胞迁移及侵袭能力较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 MCPH1基因过表达可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭能力。
2013年09期 v.26 1254-1257页 [查看摘要][在线阅读][下载 317K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 张芮铭;高正伦;方群;左静;刘海文;郑学学;刘翠;郑森元;
目的观察狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性。方法分别将0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 MOI的PM株狂犬病病毒接种至MRC-5细胞中,显微镜观察感染细胞的状态;间接免疫荧光法检测病毒收获液的滴度;小鼠NIH法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI为0.06~0.07时,病毒收获前细胞出现聚集现象,液体中基本无死细胞;病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论观察了狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性,为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。
2013年09期 v.26 1258-1259+1263页 [查看摘要][在线阅读][下载 320K] [下载次数：441 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 唐磊;杨致邦;聂佳莹;黄进;
目的原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdR蛋白(即HP1365),以探讨其在酸适应中的调控机制。方法从H.pylori 26695标准株基因组DNA中PCR扩增hp1365基因,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,转化E.coli JM109,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pGEX-hp1365经双酶切、PCR和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为25 000,主要以包涵体形式表达,可与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合。结论原核表达了H.pylori CrdR蛋白,为进一步探讨其对酸信号的感应机制及其通过阻断酸信号的感应抗H.pylori感染的途径奠定物质基础。
2013年09期 v.26 1260-1263页 [查看摘要][在线阅读][下载 202K] [下载次数：36 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨俊艳;吴婷婷;刘智敏;刘小花;王旎;董超然;
目的探讨17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)对人甲状腺滤泡状癌WRO细胞侵袭能力的影响及其机制。方法用10-8mol/L的E2处理WRO细胞不同时间(0、24、48 h),倒置显微镜下观察细胞形态的变化;RT-PCR和Western blot法检测细胞中G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)、CXCR1、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP2)和MMP9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;ELISA法检测细胞中IL-8的含量;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果随着E2处理时间的延长,WRO细胞间的间隙变大,逐渐离散成单个细胞,形态呈长梭形、纺锤形;细胞中GPER、CXCR1、MMP2和MMP9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平及分泌IL-8的水平均逐渐升高(P<0.05或P<0.01);细胞的侵袭能力明显增强(P<0.05)。结论 E2可通过上调GPER、CXCR1、MMP2、MMP9和IL-8的表达,促进WRO细胞的侵袭。
2013年09期 v.26 1264-1268+1272页 [查看摘要][在线阅读][下载 431K] [下载次数：120 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 艾丽梅;杨关林;白雪松;
目的探讨人参皂苷对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)分泌干细胞因子的影响。方法通过密度梯度离心法从健康志愿者抗凝骨髓中分离、培养BMSC,传代3代后,采用流式细胞术鉴定其细胞表型;MTT法检测不同浓度人参皂苷(50、100、150、200、300、400 mg/ml)作用不同时间(24、48、72、96 h)对BMSC增殖活性的影响;ELISA检测200 mg/ml人参皂甙作用不同时间(24、48、72 h)对BMSC分泌干细胞因子SCF-1和干细胞衍生因子SDF-1α水平的影响;RT-PCR法检测200 mg/ml人参皂甙作用24 h对BMSCSCF-1和SDF-1αmRNA转录水平的影响。结果第3代BMSC的CD44、CD29和CD105表达阳性,而CD34、CD45和HLA-DR表达阴性,BMSC的纯度为90%;BMSC与不同浓度的人参皂苷共培养不同时间,细胞的增殖活性均明显增强(P<0.05),200 mg/ml人参皂苷作用96 h细胞的增殖活性最高(P<0.05),但无明显的时间和剂量依赖性;人参皂苷对BMSC SCF-1和SDF-1α的分泌及mRNA的转录具有明显的促进作用。结论人参皂苷能增强BMSC分泌干细胞因子,有望应用于辅助干细胞治疗。
2013年09期 v.26 1269-1272页 [查看摘要][在线阅读][下载 286K] [下载次数：271 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 张春梅;邓华瑜;
目的探讨miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响。方法采用LipofectamineTM2000将miRNA-155 mimics(或带荧光无关序列阴性对照FAM-NC)转染雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性人乳腺癌MCF-7细胞,并设空白对照组;RT-PCR法检测转染后miRNA-155的表达水平;CCK-8法检测miRNA-155对MCF-7细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率和增殖周期;Western blot法检测TP53INP1、Caspase-3及p21蛋白的表达水平。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组miRNA-155的表达量明显增高;随着时间的延长,MCF-7细胞增殖活力逐渐增加;G1期细胞明显减少,S和G2期细胞增多,凋亡率明显降低;TP53INP1、Caspase-3激活型及p21蛋白的表达水平均明显降低。结论 miRNA-155能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1蛋白的表达,进而抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖,在乳腺癌发生发展中具有重要作用。
2013年09期 v.26 1273-1277页 [查看摘要][在线阅读][下载 334K] [下载次数：421 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ]
- 张占东;徐静;李计来;李树香;周亚;王欣怡;刘敬;张云涛;
目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400 HR凝胶过滤层析纯化后,与A(lOH)3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14 400~20 100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。
2013年09期 v.26 1278-1284页 [查看摘要][在线阅读][下载 502K] [下载次数：276 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 田万红;喻钢;赵志晶;董方;曾明;
目的对乳酶生生产用菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)140623株进行全面系统鉴定,检测该菌株耐药谱,为临床用药安全性提供参考。方法利用传统生化、API生化鉴定系统及16S rRNA序列测定对乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623株及标准菌株粪肠球菌32222株进行鉴定,利用琼脂扩散纸片法检测其对临床常用10类21种抗生素的敏感性,并免疫小鼠进行菌株毒性试验。结果粪肠球菌140623株为屎肠球菌(Enterococcus faecium);耐药谱显示该菌株对四环素类、氯霉素敏感,对醣肽类中度敏感,对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖甙类、大环内脂类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类抗生素及磺胺耐药;全部小鼠健康存活,符合"微生态活菌制品"菌种毒性试验要求。结论标准物质目录中标示为"供乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623"应为屎肠球菌140623株。对其耐药谱的研究可为临床联合用药及对该菌株的质量控制提供参考。
2013年09期 v.26 1285-1289页 [查看摘要][在线阅读][下载 225K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 奉婷;朱卫民;余泽波;周蓉;胡祥;
目的探讨脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)对急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植途径的优化。方法将48只SD大鼠随机分为4组:空白对照组、模型对照组以及移植治疗A、B组,每组12只,模型对照组和移植治疗组大鼠均经腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,造模后24 h,模型对照组经尾静脉注射1 ml生理盐水,空白对照组和移植治疗A组均经尾静脉注射1 ml hUCMSCs悬液,移植治疗B组经肝叶注射0.3 ml hUCMSCs悬液。移植治疗后多时间点收集血清,采用全自动生物化学分析仪检测白蛋白(albumin,ALB)、总胆红素(total bilirubin,TBil)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)含量;移植治疗后1和2周,采用Real-time PCR法检测各组大鼠肝组织中人CK8、CK18和AFP基因水平;移植治疗后3 d、1和2周,采用免疫组化SP法检测各组大鼠肝组织中人CK18蛋白的表达。结果移植治疗后24、48 h,移植治疗组与模型对照组相比,ALB、TBil和ALT含量差异有统计学意义(P均<0.05);移植治疗后1和2周,与模型对照组相比,移植治疗A和B组CK8、CK18和AFP基因水平均明显升高(P均<0.01),随造模时间的延长,基因水平也逐渐升高;移植治疗后3 d,大鼠肝脏组织中可检测到人CK18蛋白的表达,hUCMSCs在大鼠肝组织中诱导分化后,从汇管区向肝小叶中央迁移扩散;移植治疗A和B组的肝功能指标、移植细胞分化程度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论hUCMSCs能促进急性肝衰竭大鼠肝脏的修复,同时自身能分化为具有肝细胞功能的类肝样细胞,经尾静脉注射移植与经肝叶注射移植疗效相似,前者更易于应用和推广。
2013年09期 v.26 1290-1295页 [查看摘要][在线阅读][下载 289K] [下载次数：181 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 杜研;张军;李庆春;白冰;
<正>胸腺蛋白(thymus protein)是从健康乳猪新鲜胸腺中提取的具有生物活性的蛋白类水溶液,可用于胃溃疡和十二指肠溃疡的治疗。近年来,该产品在临床上越来越受到重视,但目前尚无生物活性的检测方法。本实验应用体外培养小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3),采用MTT[1]法检测胸腺蛋白口服液(修正药业集团北京修正制药有限公司生产,批号:20120501)促细胞增殖作用,为进一步用于治疗消化系统溃疡提供科学
2013年09期 v.26 1295页 [查看摘要][在线阅读][下载 38K] [下载次数：64 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 唐静;贺鹏飞;李茂光;李红;李亚南;梁丽;陈翠萍;叶强;
目的采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A、C、Y、W135群多糖含量,并对该方法进行验证。方法用三氟乙酸对四价脑膜炎球菌结合疫苗进行水解,得到各群多糖的水解产物:唾液酸、葡萄糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖胺(ManN-6-P),采用HPAEC-PAD法,CarboPac PA10分离柱分别测定缓冲提取液中的总唾液酸、葡萄糖、半乳糖、ManN-6-P的含量,利用归一化的峰面积计算相应唾液酸系数,再计算C群脑膜炎球菌唾液酸含量。对HPAEC-PAD法进行验证,并与传统火箭电泳法检测结果进行比较。结果四价脑膜炎球菌结合疫苗水解后得到的4群单糖均呈良好线性,分离度和峰形均良好;HPAEC-PAD法检测4群糖的日内和中间精密性的RSD均小于5%;各群多糖峰面积的回收率均在80%~120%之间;3批四价脑膜炎球菌多糖疫苗水解后,经HPAEC-PAD法测定的各群多糖含量与传统火箭电泳法测定结果相当。结论 HPAEC-PAD法检测四价脑膜炎球菌多糖疫苗中的A、C、Y、W135群多糖含量准确、简便、快速、可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义。
2013年09期 v.26 1313-1317页 [查看摘要][在线阅读][下载 251K] [下载次数：293 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 岳广智;杨立宏;徐宏山;刘欣玉;董关木;贾丽丽;
目的验证钴60-γ射线辐照对骨蜡中模拟污染指示病毒的灭活效果。方法将固体骨蜡制成腔壁0.7 cm厚的空心圆柱体的辐照用样品,空腔中分别加入6.61 Lg PFU/ml辛德毕(Sindbis)病毒、7.07 LgTCID50/0.1 ml脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和6.01 LgTCID50/0.1 ml猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),分别经5、10、15、20及25 kGy的钴60-γ射线进行辐照后,收集样品腔中的病毒液,采用噬斑形成法检测Sindbis病毒滴度,采用微量半数细胞病变法检测PPV和EMCV滴度。结果经不同剂量kGy钴60-γ射线辐照,Sindbis病毒、EMCV及PPV的病毒滴度随辐照剂量的增加而下降,辐照剂量增加至25 kGy时,可灭活3种病毒的量分别达6.03~6.60 LgPFU/ml、6.25~6.32 Lg TCID50/0.1 ml和4.75~4.88 LgTCID50/0.1 ml以上。结论 25 kGy的钴60-γ射线对骨蜡中的包膜和无包膜病毒均有较好的灭活效果。
2013年09期 v.26 1318-1321页 [查看摘要][在线阅读][下载 195K] [下载次数：245 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 马霄;卫辰;谭亚军;徐颖华;侯启明;
目的建立无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法。方法依据活性PT的ADP核糖基化酶活性,设计并合成一段荧光标记的合成肽Gαi3C20,以其为底物,采用柱前衍生-HPLC法检测无细胞百日咳疫苗的毒性,并对建立的方法进行验证。结果该方法的最低检测限为1 ng;最低定量检测限为8 ng,线性范围为8~400 ng/ml,区间内线性系数为0.999;用建立的方法对同一份样品平行测定10次,变异系数小于10%;该方法的回收率为94.9%;联合疫苗中的其他主要成分,如丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)、黏附素(pertactin,PRN)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)对检测结果无明显干扰。结论建立了无细胞百日咳疫苗毒性体外检测方法,该方法有望替代现行的动物检查法,可加强我国百白破联合疫苗的质量控制,提高疫苗的质量。
2013年09期 v.26 1322-1324页 [查看摘要][在线阅读][下载 208K] [下载次数：208 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 魏东;李恪梅;肖丽华;梁昊宇;裴明玉;庄新海;魏然;翟雷;王国治;
目的研制炭疽鉴别试验及炭疽活疫苗纯菌检查用炭疽噬菌体国家参考品。方法制备炭疽噬菌体参考品,建立噬菌体参考品效价质量标准,组织4个实验室对该参考品进行协作验证,并对参考品稳定性进行分析。结果研制的炭疽噬菌体国家参考品,其效价质量标准应不低于1.0×108PFU/ml;经协作验证,该参考品可有效鉴别3批炭疽活疫苗;该参考品在4℃条件下稳定性较好,37℃稳定性较差。结论研制的炭疽噬菌体国家参考品已被国家有关部门正式批准,可用于炭疽鉴别试验及炭疽活疫苗纯菌检查。
2013年09期 v.26 1325-1327页 [查看摘要][在线阅读][下载 111K] [下载次数：114 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 程弘夏;柳建银;周立;王业富;唐景峰;
目的联合运用荧光定量PCR和焦磷酸测序技术快速检测异烟肼、利福平耐药性结核分枝杆菌。方法收集结核病疑似患者痰液样本,提取样本总DNA,运用Taqman荧光定量PCR对结核分枝杆菌的感染进行快速筛查。对检测结果为阳性的样本,采用焦磷酸测序法分别对异烟肼、利福平耐药结核分枝杆菌相关基因katG、rpoB的突变热点进行测序分析,与标准菌株序列比对,判断结核分支杆菌异烟肼、利福平的药敏性。采取Bactec 960药敏法鉴定结核分枝杆菌耐药性,并与焦磷酸测序法药敏检测结果进行比较,评估焦磷酸测序法的可靠性。结果荧光定量PCR技术检测痰液样本结核分枝杆菌的准确率达98.95%,检测时间约3 h;以Bactec 960药敏法鉴定结果为标准,焦磷酸测序法对结核分枝杆菌异烟肼、利福平的药敏鉴定结果准确性分别达93.75%和96.15%,其中,对耐药菌株判断,两种方法的一致性高达98%。结论采用荧光定量PCR检测技术可快速、准确地进行结核分枝杆菌感染筛查,运用焦磷酸测序技术则可快速准确地筛查出耐药样本,从痰液样本采集到结核分枝杆菌感染筛查以及药敏报告发布,全程仅需7 h;耐药菌株的检测可靠性达98%。
2013年09期 v.26 1328-1333页 [查看摘要][在线阅读][下载 406K] [下载次数：352 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 王静;白亦昊;周长明;纪宏;武晗燕;
目的建立重组乙型肝炎疫苗(酵母)快速鉴别试验方法。方法选取不同的处理液对吸附铝佐剂的3批重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)进行解离,采用胶体金法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),筛选快速鉴别试验的最佳处理液;优化快速鉴别试验的反应温度和反应时间,并对该方法进行特异性、灵敏度和重复性验证。结果处理液A(10%Triton X-100 0.20 ml、20%二乙醇胺1.25 ml、0.01 mol/L PBS 8.55 ml)为重组乙型肝炎疫苗快速鉴别试验的最佳样品处理液;快速鉴别试验的最佳反应温度为25℃,最佳反应时间为15 min;该方法特异性较强,重复性良好,最低检出限为1.375μg/ml。结论建立了重组乙型肝炎疫苗(酵母)快速鉴别试验方法,为该疫苗的快速鉴别提供了参考。
2013年09期 v.26 1334-1336页 [查看摘要][在线阅读][下载 105K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 田阳;郑永坚;隋礼丽;
目的建立一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺。方法将A、C、Y、W135群粗糖样品溶解后,用含2%脱氧胆酸钠(SDC)的Tris-HCl缓冲液稀释,用串联的Capto Adhere和Capto DEAE介质,采用流穿模式,经一步层析将多糖与其他杂质分离,再经Sephodex G25脱盐后获得精糖原液,根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对各型样品的各项指标进行检测。结果 4群多糖均可在柱上流穿,多糖可与蛋白及核酸完全分离;纯化多糖样品的各项指标均符合《欧洲药典》标准,各群多糖的回收率均高于55%。结论建立了一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺,缩短了生产时间,提高了回收率,可替代传统的苯酚抽提工艺,用于脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖的纯化。
2013年09期 v.26 1337-1341页 [查看摘要][在线阅读][下载 304K] [下载次数：225 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 习静;徐攀;郭鹏;韩跃武;陈雪丽;张萍;王瑞玲;袁琳;陈丹;马驰;
目的评价慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)ssDNA适配子检测方法的临床诊断应用价值。方法基于前期构建的方法,用ssDNA适配子与K562细胞及临床CML标本结合进行检测,在优化的检测条件下,以美国临床实验室标准化组织(Clinical and Laboratory Standard Institude,CLSL)的相关标准为依据,对该方法进行方法学评价,并对方法进行临床诊断性能的评价。结果建立的方法回归方程为:y=1 476.4+495.31 x,r2=0.976 6,拟合度较高;该方法敏感性较高,特异性较强,检测高、中、低浓度的K562细胞的批内变异系数均小于5%,日间变异系数均大于5%;该方法测得的不同浓度CML标本的总平均回收率为78.7%;测得的溶血、黄疸及血脂标本的平均干扰率均>10.0%;ROC曲线下面积为0.867,ssDNA适配子检测CML组、非慢粒类型白血病组、健康对照组标本的敏感度为75%,特异度为77%,阳性似然比为3.26,阴性似然比为0.32,漏诊率为25%,可靠度为0.306,可用度为0.52。结论 CML ssDNA适配子检测方法本身灵敏度高,检测阈值低,特异性强;在临床诊断性能研究中,该方法特异性高,但敏感性较低,具有一定的临床诊断价值。但该方法抗干扰能力弱,重复性较差,且可靠度<0.5,其临床应用还有一定的局限性。
2013年09期 v.26 1342-1346页 [查看摘要][在线阅读][下载 242K] [下载次数：87 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 赵宏大;谢文;范文平;
目的对用于无菌检查的硫乙醇酸盐流体培养基的灵敏度进行评价。方法采用乙型溶血性链球菌(Streptococcus hemdytis-β)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)6个质控菌作为评价菌株,对92批国产和进口的硫乙醇酸盐流体培养基脱水商业化成品进行灵敏度评价,以6个菌株检测结果均能达到的灵敏度判定为该培养基对6个菌株的总体灵敏度。结果所有培养基对短芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和生孢梭菌的灵敏度均达到1~10 cfu水平,有2批培养基对枯草芽孢杆菌的灵敏度未达到1~10 cfu水平;对乙型溶血性链球菌的促生长能力差异较大,灵敏度达到1~10 cfu水平的比例仅为65%;金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌检查92批培养基的灵敏度的差异无统计学意义(P均>0.05);金黄色葡萄球菌与乙型溶血性链球菌检查92批培养基的灵敏度差异有统计学意义(P均<0.05)。结论用乙型溶血性链球菌检测培养基的灵敏度表现出显著差异,部分国产培养基对乙型溶血性链球菌的灵敏度较差,需引起药品检验工作者高度重视。
2013年09期 v.26 1347-1350页 [查看摘要][在线阅读][下载 158K] [下载次数：260 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]