- 朱传凤;傅生芳;寇桂英;陈汉泉;余黎;周旭;
目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段;重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25%,以包涵体和可溶性两种方式存在;纯化后重组蛋白纯度可达95%以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。
2012年04期 v.25 389-392页 [查看摘要][在线阅读][下载 187K] [下载次数：96 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 钟文;张群;龚艺;张彦青;陈倩;陈特;董杰;王虹;张雪梅;
目的原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)热休克蛋白ClpL,并评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性。方法PCR扩增S.pn D39全长ClpL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组ClpL蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗ClpL多克隆抗体的效价及亚型;Western blot分析ClpL蛋白在5种常见S.pn中的保守性;流式细胞术及Western blot分析ClpL蛋白在S.pn中的亚细胞定位。结果重组表达质粒pET-28a(+)-ClpL经双酶切及测序证实构建正确;ClpL蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度达90%,浓度为4.97 mg/ml;免疫小鼠可产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG1和IgG2b亚型为主;ClpL蛋白在5株常见S.pn中均有表达;ClpL蛋白为分泌型蛋白,不表达于S.pn表面。结论原核表达并纯化了S.pn ClpL蛋白,其作为一种在S.pn中保守存在的分泌型蛋白,可能是一种较好的疫苗候选蛋白。
2012年04期 v.25 393-397页 [查看摘要][在线阅读][下载 270K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 杨婷;李华;龙润乡;杨蓉;董承红;蒋蕊鞠;崔萍芳;白惠珠;谢忠平;
目的初步评价肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)与甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)灭活疫苗联合免疫小鼠诱导的特异性免疫应答水平以及两种抗原间的相互作用。方法将HAV灭活疫苗和EV71灭活疫苗以不同剂量配比制成联合疫苗,免疫ICR小鼠后,通过ELISA法检测血清HAV抗体效价;固定病毒-稀释血清法检测血清EV71中和抗体效价;流式细胞术检测脾脏中淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的百分率;ELISPOT法检测脾脏中淋巴细胞分泌IL-4和IFNγ的水平。结果初免后28 d和加强免疫后7 d,各组小鼠血清中EV71中和抗体阳转率均达100%,单价疫苗组和联合疫苗组EV71中和抗体效价均呈剂量依赖性;初免后28 d,小鼠血清中能够产生保护性HAV抗体,加强免疫后抗体水平升高;联合疫苗组与相应的单价疫苗组间抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),未发现EV71与HAV的相互作用;初免后28 d,各组小鼠脾脏中CD8+细胞比例高于CD4+细胞(P<0.001),加强免疫后7 d则相反(P<0.001);初免后28 d,HAV全病毒和EV71多肽均不能刺激各组小鼠脾细胞产生阳性反应,加强免疫后7 d,各组小鼠脾细胞分泌IL-4的水平均高于IFNγ(P<0.05)。结论一定剂量的HAV和EV71联合疫苗可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答,同时诱导细胞免疫应答,但相对较弱,未发现两种抗原间存在相互干扰或协同作用。
2012年04期 v.25 398-402页 [查看摘要][在线阅读][下载 230K] [下载次数：237 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 吴雪郡;黄英;韩洁;王模奎;王莹;王莉佳;
目的探讨不同剂量粉尘螨提取液对哮喘小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)的影响,确定粉尘螨提取液免疫治疗的最佳维持剂量。方法用粉尘螨提取液经腹腔注射C57BL/6小鼠,建立过敏性哮喘模型,将32只哮喘小鼠随机分为4组:生理盐水组以及粉尘螨低(100μg/只)、中(1 mg/只)和高(2 mg/只)剂量组,治疗完成后,采用流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞及Foxp3+CD4+CD25+Tregs的含量,ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-10、TGF-β1的水平。结果生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均<0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05);生理盐水组、粉尘螨低剂量组脾细胞中Foxp3+CD4+CD25+Tregs占CD4+CD25+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均<0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05);生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠血清中IL-10和TGF-β1的水平均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均<0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论中剂量粉尘螨提取液为哮喘特异性免疫治疗的最佳维持剂量。
2012年04期 v.25 403-406页 [查看摘要][在线阅读][下载 228K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
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<正>为缩短学术论文发表周期,提高学术论文的时效性和影响力,争取创新性科研成果的首发权,《中国生物制品学杂志》于2011年12月与中国知网(CNKI)签订《学术期刊优先数字出版合作协议》。"优先数字出版"是以印刷版期刊录用稿件为出版内容,先于印刷版期刊出版日期的数字出版方式,属于正式出版范
2012年04期 v.25 392页 [查看摘要][在线阅读][下载 41K] [下载次数：16 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>2012年3月12日,沃特世ACQUITY Ultra Performance Convergence Chromatography系统上市。该技术克服了反相色谱(LC)和气相色谱(GC)技术的局限,能完全替代正相色谱技术。新型的ACQUITY UPC2TM系统采用超高效合相色谱原理,为疏水化合物、手性化合物、脂类、热不稳定样品以及聚合物等的分析提供了强有力的工具。
2012年04期 v.25 397页 [查看摘要][在线阅读][下载 45K] [下载次数：48 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] -
<正>《中国生物制品学杂志》为报道我国生物制品研究开发重大成果和国内外最新进展的国内唯一的生物制品专业学术期刊。由国家卫生部主管,中华预防医学会和长春生物制品研究所有限责任公司主办,是中华预防医学会系列杂志之一,月刊。本刊主要刊载生物制品和生物技术产品相关领域,如预
2012年04期 v.25 402页 [查看摘要][在线阅读][下载 41K] [下载次数：19 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>尊敬的专家、读者、作者及各位同仁:您们好!自2007年8月起,《中国生物制品学杂志》网站(www.zgswj.com.cn,中文域名:中国生物制品学杂志.com)正式运行。本站网
2012年04期 v.25 432页 [查看摘要][在线阅读][下载 44K] [下载次数：16 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] -
<正>康宁公司开发出一种用于大量培养黏附细胞的可放大培养体系-CellSTACK培养室,最小的为CellSTACK-1培养室,其细胞生长面积为636 cm2;最大的为CellSTACK-40培养室,其细胞生长面积为25 440 cm2。将MDBK细胞分别接种至CellSTACK-40培养室与一种类似产品(也为40层培养室),接种量均为15 000个/cm2,用含5%马血清和青霉素/链霉素的二氧化碳依赖型培养基,
2012年04期 v.25 440页 [查看摘要][在线阅读][下载 48K] [下载次数：19 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] <正>我国首批国家级医学研究生规划教材之一的《医学免疫学实验技术》(主编柳忠辉),于2008年3月由人民卫生出版社出版。该书由国内16所大学从事相关领域研究的教授参编。全书共分为16章,相关实验技术部分不仅介绍了实验原理和实验流程,还列举了典型实验案例,并重点阐述了实验过程
2012年04期 v.25 445页 [查看摘要][在线阅读][下载 43K] [下载次数：14 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] -
<正>尊敬的用户,赛多利斯(Sartorius)于2012年3月推出一款全新的用于浓缩生物大分子的离心超滤浓缩装置VivaspinTurbo 15,有8种不同的截留分子量可供选择。更大面积的双排垂直膜使浓差极化和堵塞程度降至最低,确保最快的浓缩速度。光滑的内部设计确保在整个离心过程中保持最快的过
2012年04期 v.25 524页 [查看摘要][在线阅读][下载 43K] [下载次数：38 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 李呼伦;闫彬彬;李国忠;刘希君;王广友;徐欣;孙博;曹京燕;王丹丹;王曙晨;金连弘;
目的探讨实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis,EAN)中IL-12和IL-18的协同作用以及NKR-P1+细胞对该作用的影响。方法用200μl免疫乳剂(含230μg特异性肽段P2 53-78、2 mg结核菌素、100μl PBS和100μl弗氏不完全佐剂)免疫Lewis大鼠,建立EAN动物模型,在发病高峰期取出大鼠淋巴结,制备单核细胞悬液,在NKR-P1+细胞存在或不存在的条件下,分别或同时与IL-12(20 ng/ml)、IL-18(25 ng/ml)共培养,同时加入20μg/ml P2 53-78刺激,孵育24 h后,以1×107个活细胞/只鼠回输至正常Lewis大鼠体内,每天观察发病情况,并进行临床评分以及组织病理学检测,采用ELISA法检测细胞培养上清中IFNγ、TNF-α和IL-4的分泌水平,淋巴细胞增殖试验检测P2 53-78特异性淋巴细胞的增殖反应。结果 P2 53-78特异性淋巴细胞在IL-12或IL-18单独刺激下,可引发中等发病程度的EAN;而在IL-12和IL-18共同刺激下,引发EAN的发病程度明显加重;当删除淋巴细胞中的NKR-P1+细胞后,可引发严重的EAN;而NKR-P1+细胞删除后的P2 53-78特异性淋巴细胞与IL-12和IL-18共培养,其自身反应活性得到了抑制,并低表达IFNγ,从而抑制Th1细胞的分化。结论IL-12和IL-18的共同刺激能够增强P2 53-78特异性淋巴细胞的自身反应性;IL-12和IL-18能够诱导出高水平的IFNγ,从而促进Th1细胞的分化,其作用部分是通过NKR-P1+细胞实现的。
2012年04期 v.25 407-411+421页 [查看摘要][在线阅读][下载 331K] [下载次数：94 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 闫田静;易永芬;邓玮;文雪;屈玉玲;
目的探讨高尔基体囊泡转运蛋白(Golgi-vesicular transport protein)p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响及其机制。方法采用脂质体法将质粒pGPU6/GFP/Neo/p115(p115 shRNA)和阴性对照质粒(shNC)分别转染至BGC-823细胞中,并设空白对照组。转染后48 h,采用RT-PCR、Westernblot和细胞免疫荧光法检测各组细胞中p115基因及蛋白表达的变化,及其对巨噬细胞游走抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metallopro-teinase-2,MMP-2)、MMP-9基因和蛋白表达的调节;细胞划痕及Transwell小室试验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果p115 shRNA组细胞中p115、MIF、MMP-2、MMP-9在基因和蛋白水平的表达均较shNC组和空白对照组明显下降(P<0.01);p115shRNA组细胞的划痕愈合能力明显低于两个对照组(P<0.01);p115 shRNA组的穿膜细胞数明显低于两个对照组(P<0.01)。结论在BGC-823细胞中,抑制P115的表达后,可能通过下调MIF、MMP-2、MMP-9的表达,抑制肿瘤细胞的侵袭运动。
2012年04期 v.25 412-417页 [查看摘要][在线阅读][下载 442K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 李鹏;马艳娇;李建华;宫鹏涛;杨举;李赫;欧阳红生;张西臣;
目的探讨COL1A1基因干扰对人结肠癌HCT-8细胞增殖的影响。方法将COL1A1基因干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-COL1A1(RNAi COL1A1)和阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC(PGNsN)瞬时转染入HCT-8细胞,并设空白对照组。转染后48～72 h,采用半定量RT-PCR法检测COL1A1基因在细胞中的转录水平;MTT法检测细胞的增殖活力;并将各组细胞接种至BALB/c小鼠上皮组织中,每隔6 d分别测量小鼠体内肿瘤大小。结果 RNAi COL1A1组HCT-8细胞COL1A1基因的mRNA转录水平较PGNsN组和空白对照组显著降低(P<0.01)。RNAi COL1A1组与PGNsN组和空白对照组比较,细胞的增殖活力有所降低,第4～7天差异有统计学意义(P<0.05),其中在第5和第6天差异极显著(P<0.01)。RNAi COL1A1组小鼠体内肿瘤大小与PGNsN组和空白对照组比较,前18 d差异无统计学意义(P>0.05);在第24天,显著小于两个对照组(P<0.05);在第30天,差异极显著(P<0.01)。结论 COL1A1基因被干扰后,能够抑制HCT-8细胞增殖,为COL1A1成为癌症治疗的候选基因提供了实验依据。
2012年04期 v.25 418-421页 [查看摘要][在线阅读][下载 221K] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李红亮;陈勇;陈海容;黄程;冯一建;梅翔;何跃;范开;
目的应用AOX1和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pMD18-T-HMPIDesB30质粒,回收含短C肽AAK并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物HMPIDesB3(0Human mini-proinsulin des B30)片段,插入pGAPZαA载体中,构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30,电转化至经质粒pPIC9K-HMPIDesB30异位整合的胰岛素原分泌菌株FJ-H(1pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)中,应用抗生素法筛选高表达菌株,并进行发酵试验。结果重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30经双酶切及测序证实构建正确;经Zeocin筛选获得高表达量菌株FJ-H3。经30 L发酵罐发酵,FJ-H3菌株人胰岛素原的表达水平可达1.6 g/L,分别为FJ-H1菌株的1.6倍,FJ-H2菌株(pGAPZαA-HMP-IDesB30/GS115)的5.3倍;经质谱分析,胰蛋白酶酶切后的目的蛋白相对分子质量与理论值相符。结论利用AOX1和GAP双启动子在毕赤酵母中高效表达了人胰岛素原类似物HMPIDesB30,为实现胰岛素的规模化制备奠定了基础。
2012年04期 v.25 422-425页 [查看摘要][在线阅读][下载 233K] [下载次数：576 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] |[阅读次数：0 ] - 佘茜;徐蕾;何永林;靳志栋;张丹;杨春;
目的构建细胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达。方法以pMD19-T simple-Ipr1质粒为模板,采用PCR法扩增Ipr1基因,克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Ipr1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达的重组Ipr1蛋白相对分子质量约为70 000,以1.5 mmol/L IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的16%,重组Ipr1蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Ipr1基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组Ipr1蛋白,为进一步探讨Ipr1蛋白的功能及Ipr1重组BCG的构建奠定了基础。
2012年04期 v.25 426-428+436页 [查看摘要][在线阅读][下载 189K] [下载次数：59 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 胡仁智;宋方洲;袁成福;苟小燕;卜友泉;易发平;刘革力;吉颖;
目的探讨BRIT1基因过表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法真核表达质粒pcDNA3.1(-)/BRIT1经双酶切和测序鉴定后转染HeLa细胞,并设空载体转染组(阴性对照)和未处理组。转染后48 h,采用RT-PCR和Real timePCR法检测细胞中BRIT1基因mRNA的转录和表达情况,Western blot检测细胞中BRIT1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)/BRIT1经双酶切和测序证实构建正确;转染48 h后,可有效上调HeLa细胞中BRIT1基因mRNA和蛋白的表达,细胞凋亡率[(12.37±0.19)%]较阴性对照组[(1.81±0.22)%]和未处理组[(2.06±0.10)%]明显增加,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BRIT1基因过表达能诱导人宫颈癌HeLa细胞体外凋亡,为进一步研究BRIT1基因在宫颈癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。
2012年04期 v.25 429-432页 [查看摘要][在线阅读][下载 244K] [下载次数：134 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 任莉莉;齐晖;陈丽娟;李富荣;
目的探讨胰岛新生相关蛋白肽(Islet neogenesis associated protein-pp,INGAP-pp)对体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素水平的影响。方法取成人胰头癌患者手术中切除的胰腺组织正常胰尾部分,分离纯化胰岛进行体外培养,检测胰岛的生物学活性,并比较添加与不添加INGAP-pp培养的胰岛分泌胰岛素能力的变化。结果分离纯化的胰岛具有良好的生物学活性。在体外培养21 d后,未添加INGAP-pp的胰岛分泌胰岛素的能力逐渐丢失,胰岛形态发生显著变化,细胞团崩解后细胞逐渐死亡;而添加了INGAP-pp的胰岛形态保持相对良好,且胰岛素分泌水平从培养的第6天起均显著高于未添加组(P<0.05或P<0.01)。结论 INGAP-pp能显著促进体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素。
2012年04期 v.25 433-436页 [查看摘要][在线阅读][下载 214K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 李小凤;夏云;苏小燕;王慧娟;
目的筛选靶向晚期炎症因子高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)基因的高效RNA干扰(siRNA)序列,并检测其体外生物学效应。方法选择针对HMGB1基因mRNA的3条不同序列,用T7体外转录系统合成3条siRNA,转染RAW264.7细胞,6 h后,加入500 ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分别刺激24、48 h,另设单纯LPS刺激组和只加培养液的对照组。采用RT-PCR检测各组细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,ELISA检测细胞培养上清液中HMGB1的含量。结果体外合成的HMGB1 siRNA1～3经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见21 bp的RNA片段;经LPS刺激24和48 h,RAW264.7细胞中HMGB1基因mRMA的转录水平和细胞培养上清液中HMGB1的含量与对照组相比均显著升高,3条HMGB1 siRNA均能抑制细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,并减少细胞培养上清液中HMGB1的含量,其中以HMGB1siRNA1的效果最为明显。结论 LPS可刺激RAW264.7细胞释放大量HMGB1,同时增加细胞中mRNA的转录水平;HMGB1siRNA能有效降低HMGB1蛋白和mRNA水平,有望成为控制晚期炎症发展的新的治疗手段。
2012年04期 v.25 437-440页 [查看摘要][在线阅读][下载 197K] [下载次数：93 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 范胜涛;王丽春;赵恒;刘龙丁;李琦涵;
目的探讨干扰素(Interferon,IFN)及白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-1β在肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染过程中的作用。方法采用EV71-FY23,在IFNα1b、IFNλ1和IFNγ分别存在的条件下感染Vero细胞及KMB17细胞,检测IFN对细胞的保护作用;建立EV71感染乳鼠模型,检测IFNα1b、IFNλ1、IFNγ、IL-6及IL-1β的抗病毒作用。结果IFNα1b和IFNλ1对EV71感染的细胞具有明显的保护作用,而IFNγ的保护作用不明显;IFNα1b对感染EV71的乳鼠具有较好的保护效果,其在病毒感染之前的预处理方式产生的保护效果较为明显;IL-1β对感染EV71的乳鼠亦有不同程度的保护作用,而IL-6预处理方式不但无保护作用,反而加速了乳鼠的死亡。结论 IFN和IL-1β对EV71感染具有保护作用,而IL-6无此作用。
2012年04期 v.25 441-445页 [查看摘要][在线阅读][下载 328K] [下载次数：317 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 陈伟;于明磊;郑海军;郁心;邬敏辰;吴静;
目的克隆人白细胞介素-29(Interleukin-29,IL-29)基因并进行真核表达。方法提取人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,经逆转录合成cDNA,以其为模板,PCR扩增IL-29基因,插入真核表达载体pPIC9K,构建重组真核表达质粒pPIC9K-29,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果扩增的IL-29基因序列与GenBank中登录的序列(NM_172140)相同;重组表达质粒pPIC9K-29经双酶切及测序证实构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约30 000和27 000的特异蛋白条带,经Western blot分析,均可与羊抗人IL-29多抗发生特异性反应。结论已克隆并在毕赤酵母GS115中表达了人IL-29,为进一步研究其生物学活性及其应用奠定了基础。
2012年04期 v.25 446-448页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 连超群;张静;陈振东;夏俊;
目的探讨茶多酚(Tea polyphenols,TP)诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i及线粒体膜电位(△Ψm)的变化。方法采用MTT法检测TP对GBC-SD细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染色,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning cofocal microscopy,LSCM)观察TP对GBC-SD细胞凋亡的影响;Fluo-3 AM和Rhodamine123染色标记,LSCM观察TP对GBC-SD细胞内[Ca2+]i及△Ψm的影响。结果 TP可明显抑制GBC-SD细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性;TP能使GBC-SD细胞内[Ca2+]i增加,△Ψm降低,且呈剂量和时间效应关系。结论 TP对GBC-SD细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与其上调细胞内[Ca2+]i、降低△Ψm有关。
2012年04期 v.25 449-452+457页 [查看摘要][在线阅读][下载 456K] [下载次数：277 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 毛春梅;杨兰兰;刘先俊;
目的研究山葵提取物对结肠癌SW480细胞增殖及抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的影响。方法采用不同浓度的山葵提取物作用于SW480细胞48 h后,MTT法检测其对SW480细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布的变化;RT-PCR检测抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的变化。结果山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性,IC50值约为130μmol/L;细胞的早期、晚期凋亡率呈浓度依赖性升高,细胞周期主要阻滞于G2期;细胞中抑癌基因P16INK4amRNA的转录水平下降,且呈浓度依赖性。结论山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,并可诱导细胞凋亡;其通过抑制抑癌基因P16INK4amRNA的转录使细胞周期主要阻滞于G2期。
2012年04期 v.25 453-457页 [查看摘要][在线阅读][下载 271K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 傅雷华;王兰;喻依川;胡成琳;陈林;
目的探讨硼替佐米(Bortezomi,Bor)对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞株和急性红白血病TF1细胞株增殖、凋亡及SALL4基因和Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因C-myc、CCDN1表达的影响。方法分别用10、30、50 nmol/L的Bor处理NB4和TF1细胞12、24、48 h,并设对照组(不加Bor)。采用MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR和荧光定量PCR法检测细胞中SALL4、C-myc和CCDN1基因的表达。结果 Bor可抑制两种细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性,NB4和TF1细胞经Bor处理48 h的IC50值分别为23.97和25.36 nmol/L。Bor可诱导两种细胞凋亡,且呈剂量依赖性,经30和50 nmol/L Bor处理24 h的NB4细胞的凋亡率与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);经50 nmol/L Bor处理24 h的TF1细胞的凋亡率与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Bor可显著抑制两种细胞中SALL4基因及C-myc、CCDN1基因的表达。经50 nmol/L Bor作用24 h后,两种细胞中3种基因的表达与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。SALL4基因与C-myc和CCDN1基因的表达明显相关(rs值分别为0.857和0.929,P均<0.01)。结论 SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因C-myc和CCDN1基因表达的抑制在Bor诱导NB4和TF1细胞凋亡的过程可能起重要作用。
2012年04期 v.25 458-461+468页 [查看摘要][在线阅读][下载 321K] [下载次数：150 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 周志军;施金荣;朱华松;王平;余模松;
目的制备乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2株(简称SA)和P3株单克隆抗体,并进行初步应用。方法分别用JEV SA株减毒活疫苗和P3抗原免疫BALB/c小鼠,交叉加强免疫1次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,选择人血清白蛋白(HSA)抗体阴性、JEV抗体阳性的克隆进行2次亚克隆,制备腹水并纯化,对单抗及杂交瘤细胞进行鉴定。用SA单抗建立捕获ELISA法检测JEV抗体,竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测JEV抗原含量。结果经3次融合,共获得4株分泌抗JEV SA株单抗和3株分泌抗JEV P3株单抗的杂交瘤细胞株,未获得SA株和P3株共同决定簇的单抗;7株单抗均为IgG1型,特异性良好,但均无中和活性;SA株单抗的相对亲和力大小为:3D1>5E3>6H3>4F12,均能识别SA相同的抗原表位;P3株单抗的相对亲和力大小为:1C7>5H12>3C4,均能识别P3相同的抗原表位;7株杂交瘤细胞于液氮中放置6个月及体外连续培养3个月后,制备的腹水抗体效价保持稳定;用5E3株SA单抗建立了检测JEV抗体的捕获ELISA法及检测JEV抗原的竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法。结论已制备了JEV SA株和P3株单克隆抗体;以SA株单抗建立的捕获ELISA法检测JEV抗体比间接ELISA法更简便,且敏感性更高,对于抗原浓度高的样品,双抗体夹心ELISA法检测比竞争抑制ELISA法更有优势。
2012年04期 v.25 462-468页 [查看摘要][在线阅读][下载 294K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 董志玲;何永林;徐蕾;王静娴;张壮苗;杨静;冯鑫;杨春;
目的构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8%,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应。结论成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。
2012年04期 v.25 469-472页 [查看摘要][在线阅读][下载 187K] [下载次数：135 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 陈特;黄美容;王鹏;刘宇思;王虹;张雪梅;胥文春;
目的构建人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)基因原核表达质粒,表达并纯化带有硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的Trx-Cys C融合蛋白,并制备抗人Trx-Cys C多克隆抗体。方法在不改变氨基酸序列的前提下,对Cys C的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后,人工合成其序列,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-Cys C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose 6FF纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗人Cys C多克隆抗体,采用间接ELISA及Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确,获得的经同义密码子优化后的序列与预期一致;重组Cys C蛋白获得了可溶性表达,相对分子质量约为35 000,表达量约占菌体总蛋白的50%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可被Cys C临床检测试剂盒所识别。制备的抗人Cys C多克隆抗体效价达1∶(5.12×106)以上,并能特异性识别市售Cys C蛋白。结论已成功原核表达并纯化了可溶性重组Cys C蛋白,并制备了高效价的抗人Cys C多克隆抗体,为进一步建立Cys C免疫学检测方法奠定了基础。
2012年04期 v.25 473-476页 [查看摘要][在线阅读][下载 216K] [下载次数：169 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 张标;佟琳;易山;张光明;谢天宏;李鸿钧;孙茂盛;
目的建立一种可规模化纯化轮状病毒(Rotavirus,RV)的方法。方法以氯化铯密度梯度离心法(离心法)纯化RV作为对照,分析采用离心-微滤-超滤-层析法(模块法)纯化RV的可行性。透射电镜观察病毒形态;微量滴定法测定病毒的感染性滴度;Bradford法检测纯化前后病毒液的蛋白含量,计算蛋白回收率;以两种方法纯化的病毒免疫BALB/c小鼠,微量中和试验检测小鼠血清中和抗体滴度。结果模块法纯化的RV结构完整,感染性滴度可达(7.15±0.10)lgCCID50,可清除超过95%的蛋白质,蛋白回收率为(2.58±0.06)%,免疫小鼠可诱导中和抗体。模块法纯化的RV蛋白回收率、感染性滴度及诱导的小鼠中和抗体水平均显著高于离心法(P<0.05或P<0.01)。结论模块法可有效纯化RV,为RV灭活疫苗规模化纯化工艺的开发提供了实验依据。
2012年04期 v.25 480-482+491页 [查看摘要][在线阅读][下载 184K] [下载次数：425 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 李响;高向东;田宏;饶春明;
目的建立融合蛋白FP3等电点毛细管等电聚焦(Capillary isoelectric focusing,cIEF)电泳分析方法。方法采用中性涂层的毛细管,有效长度为20 cm,总长度为30 cm,内径为50μm;分离温度20℃;检测波长280 nm;20 Psi压力进样99 s,电压20 kV分离聚焦20 min,电压25 kV化学迁移25 min。比较不同两性电解质(PharmalyteTM3-10和AmpholineTM3.5-10)、增溶剂类型及浓度、聚焦电压(15、20、30 kV)对样品分离效果的影响,并验证系统的适应性、方法的重现性及系统的稳定性。结果建立的cIEF方法可使样品的电荷异构体有效分离,样品主峰与次主峰的分离度为1.249(USP)。AmpholineTM3.5-10可使样品的各个电荷异质性组分更有效地分离;6 mol/L尿素能提供良好的增溶环境;20 kV聚焦电压即可获得良好的分离效果。连续5次进样,主峰和次主峰迁移时间相对标准偏差(RSD)分别为1.29%和1.32%,样品主区带等电点范围为6.33～6.90,样品在24 h内检测结果稳定。结论建立了融合蛋白FP3等电点cIEF分析方法,该方法具有分离度高、重现性好、方法稳定和结果准确等优点,为该类制品的质量控制提供了更好的手段。
2012年04期 v.25 483-486页 [查看摘要][在线阅读][下载 208K] [下载次数：545 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 陈蓉;王艳;魏建忠;刘军军;孙裴;殷宗俊;李郁;
目的建立基于TaqMan探针的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)荧光定量PCR检测方法。方法根据PCV2 ORF2的相对保守序列,设计两对特异性引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性;用建立的方法对50份临床样本进行检测,并与普通PCR检测结果进行比较。结果重组质粒标准品经PCR及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.993 85;该方法的敏感性为6×101拷贝/μl,比普通PCR高2个数量级;检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟兔化弱毒均无扩增曲线;检测3份PCV2阳性模板的变异系数在0.07%～0.50%之间;临床样本的阳性检出率(64%)明显高于普通PCR(44%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论建立的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和重复性,适用于临床样本中微量PCV2的快速检测及其组织亲嗜性、细胞培养特性的研究。
2012年04期 v.25 487-491页 [查看摘要][在线阅读][下载 241K] [下载次数：322 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：0 ] - 梅林;高英杰;梁智选;赵建增;
目的建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法。方法基于高致病性PRRSV TJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证。结果高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100 bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别;建立的一步法RT-PCR可测出101TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高;对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100%相符,敏感性较高,且重复性较好。结论建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染。
2012年04期 v.25 492-494页 [查看摘要][在线阅读][下载 155K] [下载次数：413 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：17 ] |[阅读次数：0 ] - 彭艳;李平;刘苹;周元国;
目的优化pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺。方法筛选高拷贝质粒工程菌,通过优化培养基组分、发酵温度、补料成分和补料方式及培养时间,确定最佳发酵参数;以最佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批,验证优化的发酵工艺的重复性。结果最佳发酵参数为:以甘油为碳源的培养基,发酵温度25℃,以50%Glycerol梯度恒速流加方式补料,培养时间为12 h;以最佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批工程菌,菌体湿重和质粒含量分别达52.7～60.3 g/L和1.79～1.95 mg/g湿菌,质粒拷贝数为1012copies/μl,超螺旋质粒的比例达90%以上。结论优化了pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺,为重组质粒的规模化生产及下游纯化奠定了基础。
2012年04期 v.25 495-498页 [查看摘要][在线阅读][下载 220K] [下载次数：213 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张文明;洪静;孙天玮;黄国团;梁军;王大力;林殿海;
目的优化长链人胰岛素样生长因子-1(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-1,LR3IGF-1)在毕赤酵母中的表达条件。方法考察甲醇诱导浓度(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%和1.50%)、诱导温度(25、28、30℃)、pH值(4.75、5.00、5.25、5.50、5.75和6.00)及添加剂(0.1%的精氨酸、甘氨酸、组氨酸、吐温-20和吐温-80)对LR3IGF-1在毕赤酵母中表达的影响,优化LR3IGF-1的表达条件。以最佳表达条件在发酵罐中诱导表达LR3IGF-1,检测其表达量,并与初始发酵条件的表达量进行比较。结果甲醇浓度为0.75%及诱导温度为25℃时,LR3IGF-1的表达量最高,分别为76.5和98 mg/L;pH值为5.25,诱导24 h,LR3IGF-1的表达量较高,且降解程度低;添加吐温-20可使LR3IGF-1的表达量提高至271 mg/L。以优化的条件进行发酵,LR3IGF-1的表达量可达497 mg/L,较优化前(52 mg/L)提高了近9倍,且诱导时间从48 h缩短至24 h。结论优化了LR3IGF-1在毕赤酵母中的表达条件,为其规模化生产奠定了基础。
2012年04期 v.25 499-501页 [查看摘要][在线阅读][下载 164K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 李博;张家骊;夏文水;
目的建立NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法灭活壳聚糖中病毒的工艺。方法以牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,分别采用NaOH乙醇溶液和γ射线辐照法灭活壳聚糖中的BVDV和PPV,并对两种方法进行优化。以优化的灭活条件建立两步法灭活工艺,测定病毒滴度、壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和乙醇含量。结果含8 mol/L NaOH的10%乙醇溶液,35℃处理1 h后冻干,再采用γ射线辐照(5 kGy),BVDV和PPV的滴度均下降4 lgTCID50以上,同时,壳聚糖的相对分子质量仅降低8.4%,脱乙酰度无显著变化,未检出残留乙醇。结论 NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法可有效灭活壳聚糖中的指示病毒,同时对壳聚糖质量影响较小,为保证壳聚糖作为生物材料及药用辅料使用的安全性提供了保障。
2012年04期 v.25 502-505+509页 [查看摘要][在线阅读][下载 236K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 李琳;张兴秀;王健;姜容;郑敏;
目的分离、培养并鉴定SD大鼠骨髓中神经组织干细胞(Neural tissue committed stem cells,NTCSCs)。方法采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞条件培养液,从大鼠骨髓中分离、培养克隆生长的NTCSCs,采用免疫组化法对骨髓NTCSCs及其分化进行鉴定,RT-PCR法检测骨髓NTCSCs中Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA的转录。结果分离培养获得悬浮生长的细胞球,该细胞球表达神经干细胞标志Nestin及CXCR4,分化后表达神经元标志βⅢ-Tubulin和神经胶质细胞标志GFAP;该细胞中有Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA转录。结论在骨髓中成功分离到NTCSCs,其具有神经生物学特征,可作为种子细胞,在临床中枢神经系统疾病的治疗及创伤的修复中具有广阔的应用前景。
2012年04期 v.25 506-509页 [查看摘要][在线阅读][下载 256K] [下载次数：75 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 田文莉;杨江山;万亚芬;祁骥;杨旭;李小强;
目的采用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量。方法采用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量,对测定波长、乙酰丙酮、乙酸、乙酸铵浓度、保温时间、降温时间进行优化,并对方法进行验证。结果在500μl样品和4.5 ml乙酰丙酮溶液反应体系中,在0.125%乙酰丙酮、1.5%乙酸、25%乙酸铵条件下,40℃保温30 min,室温静置30 min后,在波长414 nm处测定甲醛含量,可获得最佳检测效果;在1～50μg/ml的浓度范围内标准曲线线性关系良好,回收率为101.9%,最低定量限为1μg/ml。结论应用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量简便、快速、准确,灵敏度高,适用于实验室对甲醛含量的常规检测。
2012年04期 v.25 510-512页 [查看摘要][在线阅读][下载 153K] [下载次数：203 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 胡菁;薛红刚;郭蓉;陈有喜;瞿明霞;陈浩军;
目的采用超滤法去除A群脑膜炎球菌多糖料液中的苯酚。方法选取Omega OS010C10膜包(C型筛网,10 KD,过滤面积0.1 m2)和Omega OS010T12膜包(T型筛网,10 KD,过滤面积0.1 m2),分别对A群脑膜炎球菌多糖料液进行超滤,比较两种膜包不同压力对膜滤速的影响,测定超滤前后膜净水滤速的恢复率,分析经超滤和透析后样品中磷和苯酚含量及固体总量。结果 OS010T12膜包切向流速和压力的增加对滤速的影响较OS010C10膜包更显著,且在较低的压力差和过膜压力下,OS010T12膜包具有更高的过滤速度;在浓缩和洗滤阶段,OS010T12膜包的平均滤速较OS010C10膜包高约1.3倍;膜包经清洗后,膜净水滤速OS010T12膜包可恢复至试验前水平;两种膜包超滤的滤出液中苯酚的含量均符合《中国药典》三部(2010版)要求,且多糖回收率均高达90%以上,超滤用时比透析至少节约46 h,且耗水量只有透析工艺的20%。结论可用OS010T12膜包替换透析袋,对A群脑膜炎球菌多糖料液进行超滤,去除残余苯酚,为A群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产提供了参考。
2012年04期 v.25 513-515页 [查看摘要][在线阅读][下载 139K] [下载次数：129 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]