- 吴刚;李计来;王娟;赵莉;徐静;
目的原核表达、纯化乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)(1～155)与前S1抗原(PreS1)(3～55)融合蛋白,并分析其免疫原性。方法从HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,以其为模板,PCR分别扩增HBcAg和preS1部分基因片段及融合基因CS1,将CS1基因亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET-CS1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经纯化后进行SDS-PAGE、HPLC和Western blot等分析。将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用竞争抑制法检测血清Anti-HBc水平,间接ELISA法检测Anti-PreS1水平,并检测抗体亚类;ELISPOT法评价其细胞免疫效果。结果重组原核表达质粒pET-CS1经双酶切证明构建正确;电镜分析表明粗纯的CS1可自行组装成病毒样颗粒(VLP),直径约为30 nm;SDS-PAGE和HPLC分析显示,CS1蛋白纯度分别为98.2%和93%;纯化的CS1蛋白可与兔抗人HBcAgr多抗和鼠抗人PreS1单抗特异结合,并能诱导小鼠产生Anti-HBc和Anti-PreS1抗体,抗体亚类以IgG2a为主,并能够诱生小鼠脾细胞产生HBcAg特异性的IFNγ。结论已成功原核表达并纯化了融合蛋白CS1,纯化的CS1纯度较高,能诱导机体产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应。
2011年03期 v.24 249-254页 [查看摘要][在线阅读][下载 375K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：761 ] - 刘娟;刘明远;于录;郭恒;李扬;赵丽晶;孙树民;李慧萍;刘学;王学林;
目的构建RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达。方法应用重叠延伸PCR方法,采用一定的linker序列(Gly4Ser)2将已克隆的狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein,RV-G)基因片段和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)基因片段进行融合,扩增融合基因G-linker-LTB,并插入真核表达质粒pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-G-linker-LTB,转染Vero细胞,间接免疫荧光试验和Western blot法检测融合蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pVAX1-G-linker-LTB经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染Vero细胞后,可检测到融合蛋白的表达。结论已成功构建了RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达了融合蛋白。
2011年03期 v.24 255-258页 [查看摘要][在线阅读][下载 271K] [下载次数：184 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：756 ] - 郭元元;游莉;徐兰兰;邹正渝;黎玉叶;孙双双;罗进勇;周兰;
目的构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。
2011年03期 v.24 259-262页 [查看摘要][在线阅读][下载 262K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：785 ] - 郭建巍;马骢;王珍光;钱扬会;张云;郝秀红;
目的原核表达并纯化单核李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)溶血素(Listeriolysin O,LLO)蛋白。方法用1对LM LLO基因特异性引物从LM基因组DNA中扩增LLO基因,并构建重组原核表达质粒pET-30a(+)/rLLO,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的rLLO蛋白经镍离子金属螯合柱纯化后,进行SDS-PAGE及质谱分析。结果重组表达质粒pET-30a(+)/rLLO经PCR、双酶切及测序,证明构建正确。表达的rLLO融合蛋白相对分子质量约为78 000,主要以包涵体形式表达。质谱分析显示,两个相对分子质量分别为35 000和45 000的小分子也均为LLO蛋白。结论已成功地在大肠杆菌中表达了rLLO蛋白,并进行了纯化,为进一步研究LLO蛋白的生物学功能及研制基于LLO蛋白的特异性诊断制剂奠定了基础。
2011年03期 v.24 263-265+269页 [查看摘要][在线阅读][下载 281K] [下载次数：137 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：719 ] - 佘薇薇;赵晓东;赵耀;
目的探讨人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)标准株在不同细胞中的复制动力学,确定适合分离和培养hMPV的细胞。方法将hMPV A亚型标准株hMPV/NL/1/00和B亚型标准株hMPV/NL/1/99分别接种于Vero、Vero-E6、LLC-MK2、A549和HEp-2细胞,盲传数代,逐日观察细胞病变(CPE),并于接种后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天提取细胞RNA,逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR检测hMPV F蛋白基因。结果接种hMPV后3 d可在Vero、Vero-E6、LLC-MK2和A549细胞中观察到CPE,不同亚型的hMPV所致的CPE无差别;hMPV可在Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞中稳定复制,不能在A549和HEp-2细胞中稳定传代。结论 Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞是适合培养hMPV的细胞,A549和HEp-2细胞不适合用于培养hMPV。
2011年03期 v.24 266-269页 [查看摘要][在线阅读][下载 468K] [下载次数：210 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：794 ] - 谢海伟;王娣;杨贤松;孙兰萍;张斌;许晖;
目的探讨合成抗菌肽TachyplesinⅠ在体外的生物活性及在模拟消化环境中的降解规律。方法采用不同温度、pH值、阳离子浓度、溶剂极性、模拟消化环境分别处理TachyplesinⅠ,通过检测TachyplesinⅠ生物活性的变化分析其稳定性;检测TachyplesinⅠ对小鼠血细胞的溶血活性;通过HPLC图谱变化评定TachyplesinⅠ在模拟消化环境中的降解情况。结果 TachyplesinⅠ在低于100℃、pH值小于10.3的情况下具有稳定性,阳离子浓度和溶液极性对TachyplesinⅠ的抗菌活性具有一定影响;在TachyplesinⅠ浓度大于80 mg/L时,作用时间大于30 min时,表现出一定的溶血活性;TachyplesinⅠ在模拟胃液、胃黏膜匀浆和血浆系统中表现出很高的稳定性,色谱峰型基本未改变,几乎无降解作用,TachyplesinⅠ的最小抑菌浓度为5.0～20.0 mg/L;在模拟小肠液和小肠黏膜匀浆系统中稍微敏感,色谱峰型降低,出现小杂峰,生物活性明显降低,最小抑菌浓度在80～160 mg/L之间。结论 TachyplesinⅠ具有较强的高温耐受性,在酸性条件下稳定,同时具有一定的耐受体内蛋白酶降解的能力。
2011年03期 v.24 270-275页 [查看摘要][在线阅读][下载 547K] [下载次数：186 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1413 ] - 吴柯;何百成;周岐新;
目的探讨罗格列酮对人结肠癌Lovo细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制。方法人结肠癌Lovo细胞分别经不同浓度(10-6、10-5、10-4和10-3 mol/L)的罗格列酮和美洛昔康作用6、12和24 h后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测罗格列酮处理24 h的细胞COX-2基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞COX-2蛋白的表达水平。结果罗格列酮浓度大于10-5 mol/L,美洛昔康浓度大于10-4 mol/L均可明显抑制Lovo细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性;罗格列酮可明显降低Lovo细胞COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平,且均呈浓度依赖性。结论罗格列酮能抑制人结肠癌Lovo细胞增殖,其作用机制与抑制细胞COX-2的表达有关。
2011年03期 v.24 276-279页 [查看摘要][在线阅读][下载 260K] [下载次数：95 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：771 ] - 程健;张佩;马鸣潇;李明;杨松;
目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VP1的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VP1结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段。结论本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础。
2011年03期 v.24 280-284页 [查看摘要][在线阅读][下载 588K] [下载次数：241 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：760 ] - 于昉;王轶楠;杨清;孟小丹;孙洋;台桂香;柳忠辉;
目的探讨激活素A(Activin A)及激活素结合蛋白(Follistatin,FS)在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达。方法通过1次/12 h给予小鼠5 g/Kg酒精连续灌胃3次,复制急性酒精性肝损伤小鼠模型,采用实时定量RT-PCR检测小鼠肝组织Activin A及FS mRNA表达水平,免疫组织化学染色观察小鼠肝组织Activin A及FS蛋白的表达水平。结果急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.01);FS mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A-FS表达失衡,以Activin A升高为主,提示Activin A-FS系统失衡可能与酒精性肝损伤有关。
2011年03期 v.24 285-287+291页 [查看摘要][在线阅读][下载 431K] [下载次数：176 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：826 ] - 吴晓;冉永刚;陈炯玉;游颜杰;
目的探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。
2011年03期 v.24 288-291页 [查看摘要][在线阅读][下载 240K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：959 ] - 任俊伟;杨琴;
目的探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组,线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型)、Res低剂量组(15 mg/kg,I/R+R1组)和Res高剂量组(30 mg/kg,I/R+R2组),于缺血2 h再灌注24 h进行神经功能缺损评分;化学比色法测定大鼠血清和脑组织中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;TTC法测定脑梗死体积;干湿重法测定脑含水量,HE染色观察脑组织的病理改变。结果与I/R组相比,Res能改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失(P<0.01),降低血清及脑组织中MDA的含量(P<0.01),提高SOD活性(P<0.01),缩小脑梗死体积(P<0.01),降低损伤侧脑含水量(P<0.01),改善脑组织的病理变化,且呈剂量依赖性。结论 Res对大鼠局灶性脑缺血再灌注氧化应激损伤具有良好的保护作用,其机制可能与清除自由基,减轻氧化性损伤有关。
2011年03期 v.24 292-296页 [查看摘要][在线阅读][下载 260K] [下载次数：382 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：20 ] |[阅读次数：776 ] - 高金湖;唐存多;邬敏辰;
目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。
2011年03期 v.24 297-301页 [查看摘要][在线阅读][下载 307K] [下载次数：227 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：721 ] - 张继红;温春阳;尹俐;李相军;李希宁;任立群;
目的探讨血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)对人结肠癌细胞SW1116增殖的影响及其机制。方法用不同浓度的Ang-2处理SW1116细胞,MTT法检测其对SW1116细胞增殖的影响;将SW1116细胞分为正常对照、无血清DMEM、Ang-2(1.2 mg/L)及PI3K/Akt阻断剂LY294002(10μmol/L)+Ang-2组,作用24 h后,MTT法检测LY294002对SW1116细胞增殖的影响,Western blot分析Tie-2、PI3K和Akt蛋白的表达。结果 Ang-2在1.2 mg/L时,对SW1116细胞增殖的影响最显著;LY294002能有效抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖;Ang-2组与无血清DMEM组比较,Tie-2的表达略有上升,但差异无统计学意义(P>0.05),Akt蛋白的表达显著增强(P<0.01),而PI3K蛋白的表达显著降低(P<0.01),LY294002+Ang-2组中3种蛋白的表达与Ang-2组相比,均明显降低(P均<0.01)。结论 Ang-2能促进SW1116细胞增殖,LY294002可抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖,其机制可能与Tie-2/PI3′-kinase/Akt调节的信号通路有关。
2011年03期 v.24 302-304页 [查看摘要][在线阅读][下载 217K] [下载次数：108 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：756 ] - 赵云利;吴华彰;杨晶;张杰;周纯先;
目的探讨西洋参皂甙对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法用不同浓度的西洋参皂甙[0.12、1.20和12 g/(kg.d)]灌胃小鼠,每天1次,连续灌胃21 d,第10～14天,经腹腔注射环磷酰胺0.1 g/(kg.d)。测定小鼠血中血小板(PLT)、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)的数量和血红蛋白(Hb)含量以及免疫器官重量;鸡红细胞吞噬试验检测小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,并进行二硝基氟苯(2,4-D)皮肤试验(DTH);体外测定小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞的增殖活性、腹腔巨噬细胞NO含量以及脾淋巴细胞转化功能。结果西洋参皂甙可使免疫抑制小鼠血中的PLT、WBC、RBC和Hb的降低恢复良好,并恢复小鼠免疫器官重量,2,4-D所致迟发型超敏反应减轻,促进小鼠腹腔巨噬细胞代谢,增强巨噬细胞吞噬功能,诱导巨噬细胞产生NO,提高脾淋巴细胞转化率及淋转指数。结论西洋参皂甙能提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能,增强小鼠细胞免疫与体液免疫功能。
2011年03期 v.24 305-308+312页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K] [下载次数：1163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：34 ] |[阅读次数：698 ] - 李璇;高建;杨梅;胡文艳;田绿;彭湃澜;王峰;高昌益;任红;唐开福;
目的探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用。方法取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、pcDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒pcDNA3.1(-),作为阴性对照]、Poly I∶C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly I∶C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104 U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平。结果瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβmRNA的水平显著上调。结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡。
2011年03期 v.24 309-312页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K] [下载次数：212 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：614 ] - 王旻;杨艳明;刘林林;张宇;季福健;于杰;房学东;
目的探讨新辅助化疗联合生物治疗对低位直肠癌患者手术治疗前细胞免疫功能的影响。方法选取直肠癌Dukes C期患者15例,术前采用新辅助化疗XELOX方案两个疗程后进行生物治疗。利用流式细胞仪测定新辅助化疗前及生物治疗前、后T淋巴细胞亚群、NKT细胞以及NK细胞的百分比,并评价患者的近期疗效。结果患者新辅助化疗前免疫功能低下,经新辅助化疗后,T淋巴细胞亚群、NKT细胞和NK细胞百分比均显著降低(P<0.05);经生物治疗后,T淋巴细胞亚群、NKT细胞和NK细胞百分比与生物治疗前相比,均明显升高,且差异均有统计学意义(P<0.05);患者的临床症状也有所改善,治疗有效率为20.0%,肿瘤缓解率为66.7%。结论新辅助化疗使直肠癌患者免疫功能进一步降低,在等待手术前应用生物治疗可以提高患者的细胞免疫功能,新辅助化疗联合生物治疗的方法对于提高患者的免疫状态,缩短住院时间,降低复发率具有重要意义。
2011年03期 v.24 313-316页 [查看摘要][在线阅读][下载 181K] [下载次数：272 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：680 ]