- 赵娜;张守峰;胡永浩;包世俊;王颖;张菲;刘晔;扈荣良;
目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果。方法酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建重组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养。将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度。以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度最高可达1.2×104CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%。结论已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础。
2010年04期 v.23 337-340页 [查看摘要][在线阅读][下载 186K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 戈小琴;李鸿钧;王文举;谢天宏;张光明;孙茂盛;
目的构建肠道病毒71型(EV71)P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性。方法采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物。结论已成功构建EV71P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性。
2010年04期 v.23 341-345页 [查看摘要][在线阅读][下载 337K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 屈琳;雷楗勇;张琦;丁月娣;马晓峰;陈蕴;金坚;
目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。
2010年04期 v.23 346-349+353页 [查看摘要][在线阅读][下载 286K] [下载次数：453 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：21 ] |[阅读次数：0 ] - 温中梅;李霄;刘妍;高鹏;阚式绂;王卓越;王宇航;彭丽萍;金宁一;
目的探讨表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;AnnexinV染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspase1、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化。结果Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100MOI,作用时间为48h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值(17.20%～35.04%);AnnexinV染色结果显示,Ad-HN感染48h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性。结论Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应。
2010年04期 v.23 350-353页 [查看摘要][在线阅读][下载 247K] [下载次数：164 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 季茂胜;黄峥兰;黄世峰;曾建明;刘钉宾;罗红伟;曹唯希;冯文莉;
目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。
2010年04期 v.23 354-357页 [查看摘要][在线阅读][下载 227K] [下载次数：81 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 张赢予;方春钱;陈赟;苏兆亮;张国辉;高静;
目的观察还原型谷胱甘肽(GSH)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌线粒体功能的影响。方法将SD大鼠随机分为正常对照组(C组)和糖尿病组,糖尿病组腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型。将建模成功的大鼠随机分为糖尿病心肌病模型组(DCM组)和GSH干预组(DCM+GSH组),DCM+GSH组腹腔注射GSH,C组和DCM组腹腔注射生理盐水。8周后,检测各组大鼠血清及心肌组织匀浆中的抗氧化指标、Ca2+诱导的线粒体肿胀度的变化及心肌线粒体的膜电位。结果DCM+GSH组大鼠心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶活性较DCM组显著升高,血清中SOD活性较DCM组有升高趋势,但差异无统计学意义;DCM+GSH组大鼠血清中丙二醛(MDA)含量较DCM组显著下降,心肌组织匀浆中MDA含量较DCM组有下降趋势,但差异无统计学意义;DCM+GSH组大鼠心肌线粒体对高钙诱导的肿胀的敏感性较DCM组有所恢复,但仍未恢复到正常水平;DCM+GSH组大鼠心肌线粒体膜电位较DCM组显著上升。结论GSH对STZ诱导的DCM大鼠的心脏有一定的保护作用,其可能的机制为增强心肌抗氧化能力及改善心肌组织中线粒体的功能。
2010年04期 v.23 358-360+368页 [查看摘要][在线阅读][下载 173K] [下载次数：323 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 刘倩;吴小翎;罗红春;连海峰;
目的研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌SGC7901细胞增殖及侵袭能力的影响。方法将不同浓度的硫代磷酸化修饰的MMP-2ASODN转染入人中低分化胃腺癌SGC7901细胞株,RT-PCR法检测细胞MMP-2基因mRNA的转录水平;Transwell试验检测细胞体外迁移和侵袭能力变化;MTT法检测细胞的增殖活性。结果转染MMP-2ASODN后,SGC7901细胞中MMP-2基因mRNA的转录水平显著降低,细胞的体外迁移和侵袭能力受到抑制,且抑制作用随ASODN浓度的增加而增强;而细胞的增殖活性无明显变化。结论MMP-2ASODN可抑制胃腺癌SGC7901细胞MMP-2基因mRNA的转录水平及细胞的体外迁移和侵袭能力,但与胃癌细胞的增殖活性无明显相关性。
2010年04期 v.23 361-364页 [查看摘要][在线阅读][下载 340K] [下载次数：78 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 王丽丽;魏亚强;蔡累;宋爱玲;王伟华;张英起;李志奎;
目的原核表达并纯化小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区(sIL-13Rα2)。方法将sIL-13Rα2基因克隆入原核表达载体pROEXHTa,构建重组表达质粒pROEXHTa/sIL-13Rα2,经双酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。薄层扫描分析目的蛋白的表达量,并对其进行表达形式分析及Westernblot鉴定。镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确。表达的sIL-13Rα2蛋白相对分子质量约为36200;诱导6h,重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的45%;重组蛋白以包涵体形式存在,可与大鼠抗小鼠sIL-13Rυ2单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度大于95%。结论已成功表达并纯化了sIL-13Rα2,为进一步探讨其治疗支气管哮喘奠定了基础。
2010年04期 v.23 365-368页 [查看摘要][在线阅读][下载 226K] [下载次数：97 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 李鹏飞;李明;程健;李伟伟;马鸣潇;张蕾;
目的克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。
2010年04期 v.23 369-372页 [查看摘要][在线阅读][下载 217K] [下载次数：332 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 任万军;胡云章;胡凝珠;
目的采用冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗。方法将正交试验筛选的不同冻干保护剂与1型糖尿病噬菌体展示疫苗混合,优化冻干曲线进行冻干。检测冻干前后噬菌体疫苗的滴度,并通过各项指标对冻干后的疫苗进行评价。结果经筛选,最佳保护剂配方为:10.85%海藻糖+17.37%甘氨酸(w/v);最佳冻干曲线为:S1:-40℃4h,1.5℃/min;S2:-15℃5h,1.5℃/min;S3:25℃4h,1.5℃/min;真空度:0.02mbar。冻干后疫苗滴度下降不超过0.5pfu/ml,外观及电镜观察疫苗样品形态均较好,玻璃态转化温度能达到220℃以上,含水量小于3%。结论以海藻糖、甘氨酸为保护剂,采用冷冻干燥法制备的1型糖尿病噬菌体展示疫苗具有保护剂组成成分少、热稳定性强、含水量低、冻干曲线简化、保存时间长等特点。
2010年04期 v.23 373-377页 [查看摘要][在线阅读][下载 290K] [下载次数：275 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王惟;杨知;付明山;郑海英;李芳萍;涂长春;
目的分析猪瘟疫苗免疫反应低下猪CD3+CD4+和CD4+CD25+淋巴细胞亚群的分布。方法将接种过猪瘟疫苗的种母猪经ELISA和血清中和试验检测筛选出猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性猪。从中挑选出15头作为研究对象,以15头抗体阳性猪作为对照。采集猪的抗凝血,分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术检测30头猪PBL中CD3+CD4+和CD4+CD25+淋巴细胞亚群的分布。结果CSFV抗体阴性猪PBL中CD3+CD4+细胞的比例(24.09%±1.29%)明显低于CSFV抗体阳性猪(37.49%±1.60%);CSFV抗体阴性猪PBL中CD4+CD25+细胞的比例(2.34%±0.20%)明显高于CSFV抗体阳性猪(1.64%±0.13%)。结论PBL中CD3+CD4+淋巴细胞亚群的减少及CD4+CD25+淋巴细胞亚群的增加,可能是导致猪瘟疫苗免疫反应低下的重要原因。
2010年04期 v.23 378-381页 [查看摘要][在线阅读][下载 213K] [下载次数：284 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王星晨;李郁;王桂军;孙裴;魏建忠;杨德康;张玮;
目的利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)安徽分离株制备油乳剂灭活疫苗,并进行免疫试验。方法PRRSV经Marc-145细胞传代增殖,制备油乳剂灭活疫苗;物理性状、无菌试验及安全性试验合格后,经肌肉注射免疫健康仔猪,并进行攻毒;分别检测免疫仔猪的血清抗体水平及保护力,并进行免疫程序及与市售疫苗的免疫效果的比较试验。结果制备的灭活疫苗的适宜免疫剂量为2ml/头,免疫后14d血清抗体水平可达高峰;使用同一病毒攻毒,保护率为80%(4/5)。采用灭活疫苗2次免疫及灭活疫苗与弱毒疫苗交替2次免疫,免疫效果均较好。制备的灭活疫苗免疫效果与1号市售灭活疫苗相比,差异无统计学意义,且优于2号市售灭活疫苗。结论已成功制备了PRRSV安徽分离株油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全可靠,免疫效果好,适于推广使用。
2010年04期 v.23 382-384+393页 [查看摘要][在线阅读][下载 159K] [下载次数：472 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 黄维金;张春涛;赵晨燕;王佑春;
目的初步建立HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法,并对HIV疫苗进行免疫原性评价。方法选择一种HIVDNA疫苗(D)、2种重组痘苗载体HIV疫苗(M和R),分别免疫BALB/c小鼠,6周后分离血清和脾淋巴细胞,采用ELISOPT和胞内因子染色法检测细胞因子分泌情况,MTS法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测血清中抗-HIVIgG和IgA抗体水平。结果D、M和R疫苗均可诱导小鼠产生广泛的免疫应答,ELISPOT法可检出脾细胞分泌IFNγ、IL-2、IL-4和IL-6;胞内因子染色可检出IFNγ、IL-2和IL-4的分泌;D和M组脾淋巴细胞增殖试验阳性数高于R组;D、M和R组血清抗-HIVIgG抗体分别有0/5、1/5和5/5小鼠阳转,各组均未检出血清抗-HIVIgA。结论已初步建立了HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法。
2010年04期 v.23 385-388页 [查看摘要][在线阅读][下载 228K] [下载次数：386 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 陶立峰;蒲江;宛荣生;王德海;李静;沈煜;张鑫;
目的观察注射用母牛分枝杆菌(微卡)对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制。方法C57小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37RV,建立结核菌感染小鼠模型。将模型小鼠随机分为模型组、微卡高、中、低3个剂量组和异烟肼组,同时设正常对照组。感染8周后处死小鼠,取肺、脾、肝,计算重量指数和病变总指数,测定肺脏活菌数量,并观察主要脏器的病理变化;流式细胞术测定小鼠脾脏中CD3+T、CD4+T、NK1.1+T、NK、γδT细胞的比例以及CD4+T细胞胞内IFNγ和IL-4的表达。结果微卡各剂量组能明显减轻感染小鼠的发病状况,其中微卡中剂量组的各脏器病变总指数、脾脏和肺脏重量指数、肺脏结核菌活菌数均显著低于模型组;微卡各剂量组小鼠的肺部病变主要以增殖性结节为主,而模型组则以坏死性结节和增殖性结节为主;微卡各剂量组小鼠的CD3+T、CD4+T细胞比例均明显升高,CD4+IFNγ+辅助性T细胞比例与模型组比较,差异无统计学意义;微卡低、中剂量组CD4+IL-4+辅助性T细胞比例明显降低,同时能显著提高小鼠天然免疫系统γδT和NK细胞的比例。结论微卡可提高结核菌感染小鼠天然和获得性细胞免疫水平,对结核菌感染小鼠具有较好的免疫干预作用。
2010年04期 v.23 389-393页 [查看摘要][在线阅读][下载 353K] [下载次数：188 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 衡燮;高娜;伍胤杰;林小瑞;周武刚;王微;唐聪;姜述德;杨净思;孙明波;
目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺。方法采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63lgCCID50/ml,DNA残留量均<100pg/ml。除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降。结论已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV。
2010年04期 v.23 394-395+402页 [查看摘要][在线阅读][下载 142K] [下载次数：666 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ]
- 朱霞;迟源;王好;周井祥;
<正>鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)及草鱼性腺细胞(CO)可用于鱼类疱疹病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒等常见鱼类病毒的分离培养。探讨EPC及CO细胞的适宜冻存条件,
2010年04期 v.23 381页 [查看摘要][在线阅读][下载 44K] [下载次数：332 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 马鸣潇;李明;袁春颖;李鹏飞;张轶博;苏玉虹;曲祖乙;
目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。
2010年04期 v.23 425-427页 [查看摘要][在线阅读][下载 157K] [下载次数：288 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：33 ] |[阅读次数：0 ] - 梅建国;沈志强;庄金秋;
目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。
2010年04期 v.23 428-430页 [查看摘要][在线阅读][下载 169K] [下载次数：563 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 于庭;包洪;刘爱忠;于艳辉;滕春燕;
目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,TaqⅠ酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBankBLAST软件进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体。
2010年04期 v.23 431-433页 [查看摘要][在线阅读][下载 244K] [下载次数：232 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王红梅;贾芙蓉;盛岩;井伟东;李勇;
目的建立人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)快速定量ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以兔抗人HNL多克隆抗体为包被抗体,HRP标记的HNL单克隆抗体为检测抗体,采用双抗体夹心模式,建立快速、一步定量检测HNL的ELISA方法,并进行验证及初步应用。结果最佳包被抗体工作浓度为1μg/ml,检测抗体的最佳稀释度为1∶1000,标准品浓度在0.1～10μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r>0.98。经验证,该方法的灵敏度可达0.103μg/L;检测7.2、3.6和0.9μg/L浓度的HNL标准品,试验内变异系数分别为5.6%、6.8%和9.8%,试验间变异系数分别为5.7%、6.9%和10.5%;不同浓度的平均回收率为102.04%;抑制试验表明特异性较强;健全性分析表明,样品稀释倍数对该方法无影响;8d连续检测表明稳定性良好。用建立的方法检测30份健康成人血清的HNL含量为(90.73±30.12)μg/L。结论已建立了HNL快速定量ELISA检测方法,该方法简便、快速、稳定,适合临床常规检测。
2010年04期 v.23 434-436+444页 [查看摘要][在线阅读][下载 184K] [下载次数：185 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 郑崛村;沈富兵;邓念华;孟延发;
目的分析聚乙二醇(相对分子质量40000)化促红细胞生成素(PEG-EPO)在猕猴体内的药代动力学特征。方法建立检测PEG-EPO的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证。用1、3和9mg/kg3个剂量的PEG-EPO经静脉注射猕猴,给药后各时间点检测猕猴体内的血药浓度,用DAS软件获取各剂量组药代动力学参数。结果PEG-EPO在猕猴体内的代谢过程符合二室开放模型,1、3和9mg/kg3个剂量的PEG-EPO的消除半衰期(t1/2β)分别为(51.89300±5.39558)、(42.48550±3.01606)和(56.46130±6.81932)h;AUC0～144分别为(109.32±9.82)、(236.23±36.16)和(722.55±84.31)mg/L·h。结论相对分子质量为40000的PEG修饰的EPO能显著延长其在猕猴体内的半衰期。
2010年04期 v.23 396-398页 [查看摘要][在线阅读][下载 154K] [下载次数：194 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 史新昌;韩春梅;李响;刘兰;丁有学;饶春明;
目的建立人性腺激素释放激素类似物—绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38的质控方法和质量标准。方法采用HeLa细胞/结晶紫比色法测定GP38蛋白的生物学活性,并进行精密性和回收率验证;反相高效液相色潽法(RP-HPLC)测定其纯度,用自编CPM软件进行肽图比较分析;其他检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果GP38蛋白生物学活性测定方法经验证,原液试验内变异系数(CV)为10%,试验间CV值为20%;成品试验内CV值为12%,试验间CV值为21%。用该法对GP38蛋白原液和成品进行检测,其生物学活性分别为(3736±483)和(1777±260)U/ml。原液经RP-HPLC分析,纯度为(97.1±0.2)%,符合其质量标准大于95.0%的规定。用自编CPM软件分析肽图结果显示,相同酶切条件重复检测的相似度大于0.99,不相同次酶切、相同条件重复检测的相似度大于0.90。其他各项检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的相关要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于GP38蛋白产品的常规检定。
2010年04期 v.23 399-402页 [查看摘要][在线阅读][下载 199K] [下载次数：173 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 李卫泊;尹昱;蔡建辉;张峻岭;谢绍建;薛平;周保军;严丽;
目的观察循环应用低剂量环磷酰胺(CTX)对黑色素瘤荷瘤小鼠调节性T细胞(Treg)的影响及抗瘤作用。方法通过皮下接种黑色素瘤细胞B16制备黑色素瘤荷瘤小鼠模型;对荷瘤小鼠分别经腹腔单次或循环注射CTX,每隔7d给药1次,共3次,应用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg的含量;培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),将DC与脾T淋巴细胞混合培养,应用ELISA法检测脾T淋巴细胞干扰素γ(IFNγ)的分泌量;同时测量肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,并观察各组荷瘤小鼠自身免疫病的发生情况。结果CTX的最佳应用剂量为100mg/kg。随着荷瘤时间的延长,荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+/CD4+的比值呈逐渐升高趋势。单次应用CTX抑制Treg的时间较短,而循环应用CTX能够延长对Treg的抑制,使其维持在相对较低的水平;循环应用CTX显著提高了荷瘤小鼠脾T淋巴细胞IFNγ的分泌水平。单次和循环应用CTX均未能延缓肿瘤的生长,两组小鼠均未见免疫性白斑及明显的化疗毒副反应。结论循环应用CTX能更加有效地调控Treg,从而促进DC对T淋巴细胞的抗原特异性激活,这将会提高DC疫苗的抗瘤效果。
2010年04期 v.23 403-407页 [查看摘要][在线阅读][下载 254K] [下载次数：246 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 李卫平;黄文静;孙洋;孙文娟;
目的探讨氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测氨氯地平对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响。建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,观察氨氯地平对荷瘤小鼠肿瘤的抑瘤率;HE染色观察肿瘤组织的病理改变;免疫组织化学方法检测肿瘤组织中bcl-2和bax蛋白的表达水平。结果氨氯地平作用48h可显著抑制小鼠肝癌H22细胞增殖,且呈剂量依赖性,其半数抑制浓度为5.6×10-3mg/ml。体内试验显示,氨氯地平(3和10mg/kg·d)灌胃给药10d能显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长;HE染色可见,氨氯地平给药组小鼠肿瘤细胞核染色变浅,细胞排列紧密;免疫组化显示,氨氯地平给药组小鼠肿瘤组织内bcl-2蛋白表达下调,而bax蛋白表达上调。结论氨氯地平具有明显的抑瘤作用,其抑瘤机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡相关。
2010年04期 v.23 408-411页 [查看摘要][在线阅读][下载 570K] [下载次数：199 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ]
- 杨艳玲;唐婕;白光彦;盛雪玲;王成福;王兴龙;
目的提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法。方法利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范围;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Westernblot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较。结果分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17000～80000之间;Westernblot分析显示多条特异性反应条带。膜蛋白抗原的最佳稀释度为1∶1280,抗体最佳稀释度为1∶10。所建立的ELISA方法特异性和精密性良好。ELISA检测豚鼠血清效价为1∶64000。检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%)。结论已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法。
2010年04期 v.23 412-415页 [查看摘要][在线阅读][下载 206K] [下载次数：346 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 田园;祝令伟;张国利;吴广谋;朱平;岳玉环;
目的原核表达猪干扰素γ(poIFNγ),并制备其抗血清。方法PCR扩增poIFNγ成熟多肽基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-poIFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价。结果重组原核表达质粒pET-28a-poIFNγ经双酶切和测序证明构建正确;重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达90%;制备的抗血清效价可达10-5。结论已成功地在大肠杆菌中表达了poIFNγ,并制备了较高效价的抗血清。
2010年04期 v.23 416-418+424页 [查看摘要][在线阅读][下载 191K] [下载次数：272 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]