- 张英伟;李卫东;马娜;姚忠萍;燕景恩;张勇;刘雅灵;杨佳;吴忠香;廖国阳;杨净思;李长贵;
目的以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株,为以Vero细胞为基质生产流感疫苗奠定基础。方法以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年度北半球流感疫苗生产用毒株A/Caledonia/20/99(H1N1)共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)抗体筛选重配病毒,在Vero细胞连续传12代,采用血凝抑制试验和RT-PCR鉴定病毒型别。将重配病毒经Vero细胞大量培养,重配前的病毒经鸡胚大量培养,分别经甲醛灭活,制备灭活疫苗,免疫ICR小鼠,检测其免疫原性。结果获得了1株Vero细胞适应的高产H1N1流感病毒株,连续传9代后,病毒血凝滴度维持在512,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株。
2009年06期 v.22 529-532页 [查看摘要][在线阅读][下载 163K] [下载次数：337 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：17 ] |[阅读次数：0 ] - 杨健;丁刚强;黄爱龙;
目的构建致病性大肠杆菌(EPEC)espH删除株,探讨espH分子的转位、定位以及在A/E损伤中的作用。方法构建自杀质粒pcvd442-△H::kana,通过结合传递、等位交换,抗性筛选获得espH删除株,并对删除株进行PCR鉴定;构建带HA标签的espH表达载体pTrc99a-espH:HA,转化espH删除株,感染HeLa细胞,免疫荧光技术和Western blot检测espH的转位及定位;构建espH和绿色荧光蛋白融合表达质粒p-espH-EGFP,转染HeLa细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的分布;用espH删除株感染HeLa、Caco-2和TC-7细胞,分别用荧光显微镜技术、上皮细胞电阻(TER)检测和扫描电镜(SEM)探讨espH在基垫形成、屏障功能障碍和微绒毛脱落损伤中的作用。结果酶切、测序及PCR鉴定表明自杀质粒pcvd442-△H::kana和espH删除株构建正确。espH依赖T3SS转位到宿主细胞,转位后,Western blot检测发现espH主要分布于细胞的可溶性成分,免疫荧光检测发现espH分布于细胞膜基垫形成处,espH与EGFP的融合蛋白分布于细胞膜。感染试验表明,espH删除株可以形成基垫,并造成Caco-2细胞屏障功能障碍和TC-7细胞微绒毛脱落损伤。结论已成功构建了EPECespH删除株。espH是EPEC的一个依赖T3SS转位的效应分子,转位后,蛋白分布于细胞膜基垫形成处,但未发现espH在EPEC基垫形成、屏障功能障碍和微绒毛脱落方面具有重要作用。
2009年06期 v.22 533-539页 [查看摘要][在线阅读][下载 411K] [下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 薛冠华;李慎涛;杨永弘;于丽华;王爱华;王冠;殷国荣;沈叙庄;
目的探讨B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip)的黏膜免疫效果。方法表达及纯化两种不同标签的Sip(Gp-Sip和pET-Sip),质谱分析法鉴定纯化蛋白。用Gp-Sip免疫BALB/c小鼠,pET-Sip检测免疫小鼠血清及阴道黏膜萃取液中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的调理吞噬活性。结果经质谱分析和蛋白质库比较证实,纯化的Gp-Sip和pET-Sip为B族链球菌Sip的可能性分值分别为177和92。ELISA检测结果显示,Sip+CT经鼻内及直肠两种途径黏膜免疫后,均可诱发小鼠产生高水平的血清IgG及阴道黏膜IgA抗体,鼻内免疫效果优于直肠;不同剂量的Sip+CT鼻内免疫后,均可在血清及阴道黏膜中检出高水平的IgG和IgA抗体,组间比较差异无统计学意义;CT和CpG-ODN1826鼻内免疫均可促进Sip产生较好的黏膜免疫效果,二者之间差异无统计学意义。Sip抗血清可明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论Sip具有较好的黏膜免疫原性,鼻内黏膜免疫效果优于直肠,CT和CpG-ODN1826两种佐剂均可有效提高Sip的免疫原性。
2009年06期 v.22 540-543+551页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K] [下载次数：193 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 欧阳萍;雷连成;吕爽;韩文瑜;赵瑞利;姜秋杰;
目的在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性。方法将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性。结果经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确。SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达。纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性。重组hLYZ酶活性为2389U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性。
2009年06期 v.22 544-547页 [查看摘要][在线阅读][下载 239K] [下载次数：447 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：0 ] - 于涛;孙治君;陈建生;
目的探讨趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性,以及乌斯他丁(UTI)对其表达的影响。方法采用流式细胞术和RT-PCR法检测22例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织、正常组织以及乳腺癌细胞MDA-MB-231中CXCR4在蛋白和mRNA水平的表达情况,以及UTI对MDA-MB-231细胞CXCR4表达的影响。结果在乳腺癌组织和MDA-MB-231细胞中,CXCR4在蛋白和mRNA水平的表达均显著高于癌旁组织和正常组织,且CXCR4的表达与乳腺癌的转移密切相关;UTI能下调CXCR4的表达,经UTI作用后,MDA-MB-231细胞的趋化活性降低。结论CXCR4在乳腺癌中高表达,在乳腺癌的转移中起重要作用,下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平可减少或抑制其转移。
2009年06期 v.22 548-551页 [查看摘要][在线阅读][下载 180K] [下载次数：63 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 邬冬云;王战会;周向军;蒋英丽;李进;
目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。
2009年06期 v.22 552-555页 [查看摘要][在线阅读][下载 181K] [下载次数：224 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张黎;王瑜伟;何永林;帖儒修;
目的构建含人颗粒溶素(GLS)活性肽和小鼠单链白细胞介素-12(mIL-12)基因的重组卡介苗(BCG),并鉴定其向真核细胞递呈质粒的能力。方法以分子生物学方法构建含相对分子质量为9000的颗粒溶素活性肽基因和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM9,以电转化的方式将pBM9质粒转入BCG,构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定;将重组菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,经RT-PCR检测重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果重组BCG可扩增出与GLS基因和mIL-12基因相符的目的条带。重组BCG感染RAW264.7细胞96h后,经RT-PCR可扩增出267bp的GLS基因条带和1632bp的mIL-12基因条带。结论已成功构建含GLS和mIL-12基因的重组BCG,该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带的目的基因。
2009年06期 v.22 556-559页 [查看摘要][在线阅读][下载 377K] [下载次数：58 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 陈芳芳;冯野;王轶楠;台桂香;周静;刘海岩;葛敬岩;崔雪玲;柳忠辉;
目的探讨激活素A(ActivinA)对巨噬细胞系RAW264.7细胞活性的调节作用及其可能的机制。方法取对数生长期的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,加入1μg/ml脂多糖(LPS),继续培养8h,采用ELISA法检测细胞分泌ActivinA水平;分别加入ActivinA、LPS和ActivinA+LPS,中性红染料法检测细胞吞饮活性;流式细胞术分析细胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ及Toll样受体4(TLR4)的表达水平。结果LPS呈时间依赖性刺激RAW264.7细胞分泌ActivinA;ActivinA可明显促进静息RAW264.7细胞的吞饮活性,而对MHCⅠ、MHCⅡ及TLR4的表达水平无明显影响;ActivinA和LPS共同作用,ActivinA明显抑制了LPS活化的RAW264.7细胞的吞饮活性,并下调TLR4的表达。结论ActivinA可能以自分泌/旁分泌形式参与巨噬细胞活性调节,其抑制LPS作用与TLR4表达有关。
2009年06期 v.22 560-562页 [查看摘要][在线阅读][下载 170K] [下载次数：356 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 钱冠华;蒲淑萍;郭风劲;Tsutomu MORI;Hideo KOCHI;段昌柱;
目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。
2009年06期 v.22 563-566页 [查看摘要][在线阅读][下载 259K] [下载次数：565 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 张万菊;郑丽舒;张骞;谢志萍;张钫;麻粉莲;刘斌;
目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。
2009年06期 v.22 567-570页 [查看摘要][在线阅读][下载 263K] [下载次数：311 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 车昌燕;张国华;刘力;
目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。
2009年06期 v.22 571-573+582页 [查看摘要][在线阅读][下载 190K] [下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 谢忠平;李华;龙润乡;易红昆;沈冬;李志强;崔萍芳;蒋蕊鞠;
目的在不同细胞中培养人呼吸道合胞病毒(HRSV),并分析其影响因素,为病毒的大量增殖创造条件。方法将HRSVA2株分别接种至人二倍体KMB17细胞、Vero细胞、人喉癌Hep-2细胞及HeLa细胞进行培养,采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度,并进行间接免疫荧光试验及合胞体观察。检测吸附时间、维持液pH值和培养温度对病毒增殖的影响。结果4种细胞中,Vero细胞对HRSV最敏感,病变早、病毒感染性滴度可达6.83lgCCID50/ml;KMB17细胞相对敏感性不高,但仍能良好增殖,病毒感染性滴度达6.13lgCCID50/ml;Hep-2细胞及HeLa细胞介于Vero细胞和KMB17细胞之间,病毒感染性滴度也达到6.83lgCCID50/ml。间接免疫荧光试验显示病毒在细胞浆内增殖。吸附时间对HRSV的增殖无明显影响;维持液的pH值对HRSV的增殖及病变特点均有一定的影响,在pH7.0～7.2时可快速引起细胞产生病变,并能达到最高感染性滴度;HRSV在37℃及32℃下培养均能良好地增殖。结论HRSVA2株在KMB17、Vero、Hep-2及HeLa细胞内均可增殖,但敏感性有一定差异,且对培养条件有一定的要求。
2009年06期 v.22 574-577页 [查看摘要][在线阅读][下载 283K] [下载次数：327 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 吕金星;袁成福;刘涛;易发平;卜友泉;刘革力;刘智敏;宋方洲;
目的构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,并观察其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响。方法根据GenBank中登录的人CD147基因序列,设计并合成针对CD147基因的特异性小干扰片段,并将其定向克隆至带有卡那霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染至HeLa细胞中,观察其对HeLa细胞CD147基因mRNA及蛋白表达水平的影响。结果酶切鉴定和测序结果表明,3个表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒构建正确。3个siRNA真核表达质粒对HeLa细胞CD147基因mRNA转录水平的抑制率分别为32.5%、66.8%和59.1%;对CD147蛋白表达水平的抑制率分别为28.3%、63.5%和56.2%。结论已成功构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,其对HeLa细胞CD147基因的表达具有明显的抑制作用,为进一步研究CD147基因的功能奠定了基础。
2009年06期 v.22 578-582页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] [下载次数：123 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ]
- 赵爱华;贾淑珍;寇丽杰;乔来艳;王国治;
目的比较我国生产用卡介菌上海菌株与国际常用卡介菌亚株(巴斯德1173P2株、法国F6株、丹麦1331株、丹麦2株、日本172株、Connaught)在分子遗传学上的差异。方法应用PCR和多重PCR方法,对国内外不同卡介菌的各缺失区(RD1、RD2、RD8、RD14、RD16、nRD18、RDDenmark/Glaxo)、插入序列IS6110拷贝数及基因座SenX3-Regx3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海菌株(BCG Chinese)缺失RD1和RD2,不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDen-mark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有3个串联重复序列,PCR产物为353bp;巴斯德1173P2株缺失RD1、RD2、RD14和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;法国F6株缺失RD1、RD2和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦1331株缺失RD1、RD2及RDDenmark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦2株与丹麦1331株相似,只是SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列和3个串联重复序列并存的现象;日本172株只缺失RD1,RD16只显示401bp的产物,含有2个IS6110插入序列;Connaught株缺失RD1、RD2、RD8及nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有1个串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海菌株与国外其他卡介菌亚株在分子遗传学特性上有一定的差异。
2009年06期 v.22 583-587页 [查看摘要][在线阅读][下载 234K] [下载次数：229 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 孙瑞芹;高云英;王新卫;何宏轩;
目的制备禽流感病毒抗原-抗体复合物,并检测其免疫原性。方法以H5亚型禽流感病毒的HA蛋白为抗原,其病毒的高免卵黄为抗体,将抗原与抗体按不同比例混合,制备禽流感病毒抗原抗体复合物。免疫1日龄SPF仔鸡,进行保护力试验;于免疫后不同时间检测血清HI抗体水平,并与H5亚型油乳剂灭活疫苗进行比较。结果抗原与抗体比例为1∶0.6的抗原-抗体复合物在免疫仔鸡15d后,其诱导的平均抗体水平达6.5log2,与H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗(6.2log2)相比,差异无统计学意义;在等量病毒攻击后,二者对仔鸡的保护率相同(93.3%)。结论制备的禽流感病毒抗原-抗体复合物具有良好的免疫原性,为研制禽流感新型复合物疫苗提供了依据。
2009年06期 v.22 588-590页 [查看摘要][在线阅读][下载 150K] [下载次数：279 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 李薇;李振平;孙燕;韩德胜;周丽娟;范秀娟;王玉琳;
目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。
2009年06期 v.22 591-592+595页 [查看摘要][在线阅读][下载 124K] [下载次数：485 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 刘铮;孙明波;高菁霞;马磊;林小瑞;燕景恩;张勇;吴忠香;刘雅灵;姚忠萍;廖国阳;李卫东;
目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。
2009年06期 v.22 593-595页 [查看摘要][在线阅读][下载 122K] [下载次数：591 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：16 ] |[阅读次数：0 ]