- 许乐燕;徐闻青;徐帆洪;王兵;张秀娟;
目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。
2008年10期 833-837页 [查看摘要][在线阅读][下载 145K] [下载次数：198 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] |[阅读次数：0 ] - 雷连成;韩文瑜;孙长江;杨鹏;冯新;
目的筛选猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)1型与5型特异的疫苗候选基因,并研究痤疮丙酸杆菌对猪传染性胸膜肺炎的异源免疫。方法采用cDNA代表性差异分析、大肠杆菌核糖体展示、免疫筛选和RT-PCR技术筛选APP1型和5型血清型特异的疫苗候选基因,进行克隆、测序及同源序列分析。并用与APP疫苗候选基因具有同源序列的痤疮丙酸杆菌(PA)免疫小鼠,研究其对APP感染的异源免疫。结果获得血清1型APP6条疫苗候选基因,2条为未知基因,2条与PA同源性为98%,2条与人cDNA有同源性。获得血清5型APP7条疫苗候选基因,其中2条为未知基因,2条与PA同源性分别为93%和100%。用PA全菌免疫小鼠,产生的抗血清可与1型和5型APP发生强的免疫反应,ELISA检测效价达1∶3200;脾淋巴细胞检测结果显示,免疫组CD3+、CD4+T细胞的百分率及CD4+/CD8+比值与对照组相比均升高,两组CD3+T细胞百分率差异有显著意义。以10倍LD501型和5型APP分别感染PA免疫小鼠,小鼠存活率分别为95%和90%,并且在攻毒后第15天体内APP可全部被清除。结论1型与5型APP存在不同的疫苗候选基因,痤疮丙酸杆菌与之存在共同抗原,能够产生交叉免疫应答,对血清1型和5型APP的感染具有预防作用。
2008年10期 838-842页 [查看摘要][在线阅读][下载 163K] [下载次数：192 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 拜明军;沈薇;洪江龙;
目的探讨不同性质脂肪酸对脂肪变性L02肝细胞凋亡和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响。方法用油酸(不饱和脂肪酸)和软脂酸(饱和脂肪酸)分别诱导建立L02细胞脂肪变性模型;油红O染色观察细胞内脂滴的变化;甘油三酯(TG)试剂盒检测细胞内TG含量;流式细胞术Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率;AO/EB染色法观察细胞凋亡形态;Westernblot和RT-PCR法分别检测GRP78蛋白和mRNA的表达。结果不同性质的脂肪酸均可导致L02细胞发生以甘油三酯升高为特点的脂肪变性。流式细胞术及AO/EB染色形态观察显示,两种类型的脂肪酸均可引起不同程度的肝细胞凋亡,软脂酸组在48和72h的细胞凋亡率显著高于对照组、DMSO组以及油酸组,同时伴有GRP78蛋白及mRNA表达的明显增加。结论油酸不能影响GRP78的表达,饱和脂肪酸可能通过上调葡萄糖调节蛋白78的表达诱导脂肪变性肝细胞的凋亡。
2008年10期 843-847页 [查看摘要][在线阅读][下载 1092K] [下载次数：222 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 曹传平;陈晓虹;吴建国;商阿丽;虞慧华;康五朋;郑玲莉;张敬;鞠佃文;
目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。
2008年10期 848-851页 [查看摘要][在线阅读][下载 183K] [下载次数：221 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 魏树源;陈晓琦;桂金柱;祁春华;王珍;
目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。
2008年10期 852-857页 [查看摘要][在线阅读][下载 113K] [下载次数：91 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 徐艳红;石琳;张涛;冯春玲;刘红芹;屈浩;黄丽华;朱卫彬;张宇光;
目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。
2008年10期 858-860+868页 [查看摘要][在线阅读][下载 107K] [下载次数：71 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 宫鹏涛;王秋悦;曹利利;张西臣;李建华;杨举;蔡亚南;续哲莉;
目的探讨RNA保护剂对乳腺癌组织DNA及核蛋白丰度和质量的影响,为深入研究乳腺癌基因转录调控奠定基础。方法将临床摘除的乳腺癌新鲜组织放入RNA保护剂内浸泡过夜后,分别于-20℃保存及-80℃超低温冷冻保存。提取相应的DNA及核蛋白,进行浓度测定,通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,SDS-PAGE检测核蛋白的质量,并经Bandscan软件分析蛋白质电泳结果。结果经RNA保护剂处理的乳腺癌组织提取的DNA和核蛋白的浓度明显高于-80℃超低温冷冻保存组织提取的DNA和核蛋白浓度,两种保护剂保存的乳腺癌组织提取的DNA浓度差异无显著意义。但RNA保护剂处理组与-80℃超低温冷冻处理组相比,在相对分子质量66200和31000处的蛋白含量有明显差异。结论RNA保护剂对乳腺癌组织的DNA浓度及核蛋白的浓度和质量有明显影响。
2008年10期 861-864页 [查看摘要][在线阅读][下载 84K] [下载次数：180 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 高世同;张仁利;刘会娟;秦莉;耿艺介;黄达娜;吴少庭;
目的在大肠埃希菌中表达金黄葡萄球菌野生株肠毒素B(SEB)重组蛋白,并进行纯化。方法采用PCR方法从金黄葡萄球菌基因组中扩增出SEB基因片段,与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T/SEB,测序分析后,亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,转化感受态E.coliJM109,IPTG诱导表达。表达产物采用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit纯化后进行Western blot鉴定。结果SEB基因扩增片段大小为705bp,测序结果显示与金黄葡萄球菌S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%,存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364、699、899和988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser和Met→Leu);表达的含GST的融合蛋白相对分子质量约53000,纯化后经SDS-PAGE分析,可见单一条带。Western blot显示表达产物可被兔抗SEB抗体所识别。结论已成功表达并纯化了金黄葡萄球菌野生株SEB重组蛋白,为开发SEB免疫诊断试剂提供了材料。
2008年10期 865-868页 [查看摘要][在线阅读][下载 150K] [下载次数：125 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 祝雯;谢东扬;林奇英;谢联辉;吴祖建;
目的分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析。方法通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶。SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响。结果经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31000。该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子。该酶的最适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性最高。结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶。
2008年10期 869-872页 [查看摘要][在线阅读][下载 665K] [下载次数：155 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 张华;陈伟;张晓峰;周南;刘群英;汤鲁宏;邓超;
目的分析和纯化刀额新对虾组织蛋白中的变应原组分,为进一步研制虾源性过敏反应疾病的诊断试剂和脱敏药物奠定基础。方法刀额新对虾粗提蛋白经SDS-PAGE分离,用虾过敏患者血清,经Western blot分析其变应原组分。以DEAE-52离子交换层析纯化主要变应原组分,用虾过敏患者血清对纯化产物进行ELISA分析。结果SDS-PAGE分析显示,刀额新对虾粗提蛋白约有20条可辨蛋白带,相对分子质量在12100～105600之间。Western blot分析显示,12份虾过敏患者血清与粗提蛋白均呈阳性反应。粗提蛋白有7条蛋白条带反应率高,其中相对分子质量为36000、46200、60000和68000的4条蛋白带与所有12份患者血清均呈阳性反应。经DEAE-52离子交换层析纯化后,ELISA结果显示,变应原主要集中在70%盐析段0.1mol/L洗脱峰内。结论刀额新对虾组织蛋白中的相对分子质量为36000、46200、60000和68000的组分是其主要变应原。
2008年10期 873-875+883页 [查看摘要][在线阅读][下载 165K] [下载次数：78 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ]
- 唐旭;殷国荣;杨建一;
<正>小鼠是使用最多的实验动物,在胚胎、药理、毒理、遗传学等实验研究中常用孕鼠为动物模型。准确的妊娠诊断是建立孕鼠模型的关键。常用的小鼠妊娠诊断法有阴栓目测检查法和阴道精子涂片检查法。阴栓检查法简单易行,较为常用。但由于小鼠阴栓大小不一,大则凸出于阴道口,小则在阴道或
2008年10期 898页 [查看摘要][在线阅读][下载 13K] [下载次数：691 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 丛艳昭;鲁承;金宁一;申镇维;梁晓枫;金洪涛;白靓;牟伟锋;于长勇;常巧呈;齐楷;金明杰;
目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。
2008年10期 899-902页 [查看摘要][在线阅读][下载 254K] [下载次数：610 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 吴静;刘娟娟;殷国荣;孟晓丽;刘红丽;王海龙;
目的筛选Vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)的适宜条件。方法采用拉丁方析因设计。第一部分:在血清浓度为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的培养基中,共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养3、6、12、24h时,改为无血清培养基,继续培养至第7天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。第二部分:在含1.0%血清培养基中共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养12、24、48、72h时,改为无血清培养基,继续培养至第7、9、11、13天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。结果Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12或24h时,无血清培养基继续培养7d,制备的ESA蛋白含量显著高于其他血清浓度(0.5%、2.0%、4.0%)及含血清培养时间(3、6h)。Vero细胞与弓形虫速殖子在含1.0%血清培养基中共培养12、24h,无血清培养基继续培养至第13天,制备的ESA蛋白含量显著高于其他培养时间(48、72h)和无血清培养基继续培养时间(7、9、11d)。结论培养基的血清浓度以及含血清和无血清培养时间是影响体外制备ESA的重要因素。Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12h,无血清培养基继续培养13d,为制备ESA的适宜条件。
2008年10期 903-905页 [查看摘要][在线阅读][下载 32K] [下载次数：144 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 赵彦鼎;张鹏宇;杨博;郭立安;贺浪冲;
目的采用自制的DEAE Bio-SepFF和肝素Bio-Sep FF介质,从人血浆中快速分离纯化凝血因子Ⅸ(FⅨ)。方法低温离心去除冷沉淀后的人血浆,在不同淋洗条件下,经过两步弱阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FⅨ,用活性检测试剂盒检测各组分凝血因子的活性,Bradford法测定蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度。结果经过三步层析分离,得到的FⅨ比活达到99.40IU/mg,纯化倍数为3823倍,回收率约为30%,纯度较高。结论采用该方法和介质,可从人血浆中纯化FⅨ,且效果较好。
2008年10期 906-908页 [查看摘要][在线阅读][下载 198K] [下载次数：145 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘殿峰;刘秀霞;李贵财;高洪喜;杨淑萍;孙玉成;
目的建立清洁级金黄地鼠种群。方法将普通金黄地鼠通过剖腹手术产的仔鼠经SPF级金黄地鼠代乳鼠哺乳,繁育建立清洁级金黄地鼠种群,并测定净化前后金黄地鼠连续3胎仔鼠与繁殖力相关的生物学特性。结果净化前后的金黄地鼠连续3胎仔鼠的平均初生重、产仔数、离乳率和胎间隔差异均无显著意义。结论已建立了清洁级金黄地鼠种群。
2008年10期 909-910页 [查看摘要][在线阅读][下载 19K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 伍伟健;郭如华;
目的探讨ELISA试验灰区设置方法,以防止弱阳性标本漏检。方法对不同浓度的HBsAg强阳性血清进行ELISA检测,得出一系列的S/CO()值和变异系数(CV)值;以S/CO()值为自变量、CV为应变量,拟合方程,得到反映S/CO值与CV值的对应关系的方程式;根据方程计算S/CO()值为1时(临界值血清)的CV;根据灰区计算公式1±2×CV,计算灰区上下限,即为灰区的范围。结果HBsAg强阳性血清ELISA试验的S/CO()随血清浓度的增加而增大,CV则相应变小。HBsAgELISA诊断试剂试验灰区范围(S/CO值)为:0.686～1.314。结论本方法得到的ELISA试验灰区范围比较接近真实状态,比按固定比例设定灰区更具合理性和科学性。
2008年10期 911-912页 [查看摘要][在线阅读][下载 22K] [下载次数：387 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：32 ] |[阅读次数：0 ]