- 杨京生;喻刚;胡勇;全家妩;
目的筛选合适的人白细胞介素-18(hIL-18)突变体,并检测其活性。方法运用分子模建工具,模建出IL-18受体及IL-18/IL-18R复合物的分子结构,分别虚拟突变IL-18的4个半胱氨酸为另外19种氨基酸,以野生型IL-18为模板进行同源模建,建立其三维结构模型,计算其IL-18/IL-18R复合物三维结构及分子间作用能变化情况,筛选几种突变方案。运用分子生物学技术构建突变体,表达纯化后进行活性检测。结果根据理论预测情况,筛选了12株突变体。突变的质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。突变体蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度大于90%。纯化的C38Glu、C127Ser等几株突变体在低浓度时,活性轻微上升,与理论预测结果基本相同。结论已成功构建了多株IL-18的突变体,运用生物信息学方法进行先期筛选有助于加快IL-18的突变研究。
2008年08期 641-646页 [查看摘要][在线阅读][下载 779K] [下载次数：83 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴永强;董关木;秦思远;杨晓明;
目的构建大容量(>108)的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue,构建工作库。结果所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010,滴度至少为1×1013。结论已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库。
2008年08期 647-650页 [查看摘要][在线阅读][下载 147K] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 刘伟;丁壮;宣华;丛彦龙;宋战昀;李少丽;
目的鉴定鸡源副黏病毒F48E9株的自然宿主细胞膜受体。方法采用蛋白膜提取试剂盒提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,用改进的间接ELISA方法检测鸡源副黏病毒分离株F48E9与细胞膜的结合活性,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定新城疫病毒(NDV)的自然宿主细胞膜受体。结果NDV与鸡胚成纤维细胞膜有很强的结合力,在转印鸡胚成纤维细胞膜蛋白的PVDF膜上有几条明显的疑似受体条带,相对分子质量介于35000～60000之间。结论初步鉴定了NDV自然宿主细胞膜的受体,其疑似受体蛋白的性质及在新城疫病毒致病中的作用尚有待进一步研究。
2008年08期 651-653页 [查看摘要][在线阅读][下载 88K] [下载次数：417 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：9 ] |[阅读次数：0 ] - 陈哲文;金于兰;黄海武;俞宏杰;王灿珍;瞿爱东;
目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。
2008年08期 654-657页 [查看摘要][在线阅读][下载 221K] [下载次数：501 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 谷长维;金宁一;霍晓伟;李太元;鲁会军;郑敏;常巧呈;于长勇;牟伟峰;胡博;马鸣潇;
目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。
2008年08期 658-661页 [查看摘要][在线阅读][下载 138K] [下载次数：118 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 谢俊秋;张庆华;张雪燕;姚海燕;韩跃武;
目的克隆并表达抑制新城疫病毒(NDV)繁殖的九肽(Nonapeptide)及其突变体基因。方法设计并合成Non-apeptide2串联体及其突变体基因,克隆于质粒pUC18,经酶切回收目的基因,与经相同酶切的表达载体pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定。IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。阳性重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约29000处可见一明显条带,与理论值相符。Nonapeptide 2及其突变体蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的41%和37%。Western blot结果显示两种蛋白均具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了抗NDV繁殖的Nonapeptide及其突变体基因。
2008年08期 662-664+668页 [查看摘要][在线阅读][下载 171K] [下载次数：61 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 王毅;宿晓云;石毅;王阳;周余来;原田守;山田亮;伊东恭悟;
目的检测前列腺特异性抗原(PSA)在结肠癌中的表达水平,探讨PSA作为结肠癌主动免疫治疗新靶点的可能性。方法用RT-PCR方法检测结肠癌细胞系中PSAmRNA的表达水平;免疫组织化学方法检测结肠癌细胞中PSA蛋白的表达水平。利用PAP表位肽对结肠癌患者的PBMCs进行体外诱导,ELISA法检测PSA特异性IFN-γ分泌水平;51Cr释放法检测PSA多肽特异性CTLs对结肠癌细胞的细胞毒性。结果4种结肠癌细胞(colo201,colo205,SW480和SW620)表达PSA mRNA和PSA蛋白。HLA-A+24结肠癌患者的PBMCs经体外诱导产生的CTLs可特异性杀伤HLA-A24+/PSA+的结肠癌细胞,CTLs的细胞毒活性依赖于CD8+的T淋巴细胞。结论结肠癌患者的外周血中存在PSA特异性CTLs前体细胞,PSA有可能成为结肠癌特异性免疫治疗的靶点。
2008年08期 665-668页 [查看摘要][在线阅读][下载 165K] [下载次数：44 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王晓春;梁景平;郭炳诗;张秀丽;
目的比较健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,以探讨MMP-2和MMP-9在龋病发病机制中的作用。方法培养健康牙齿和龋齿成牙本质细胞,利用酶谱分析细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的活性。结果龋齿组中MMP-2和MMP-9的活性显著高于健康组。结论MMP-2和MMP-9在健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中的活性不同,提示MMPs可能在龋病的进展过程中发挥作用。
2008年08期 669-671页 [查看摘要][在线阅读][下载 142K] [下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 谢淑丽;苏学今;孙梅;陈志明;全成实;
目的研究RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响。方法以RNAi沉默Bel7402细胞RhoC基因的表达,FACS和RT-PCR检测细胞凋亡和凋亡相关基因水平,细胞划痕损伤和软琼脂克隆形成试验检测细胞迁移和生长特性。结果RNAi组细胞凋亡率明显高于细胞对照组,RNAi组Bcl-2表达水平明显低于细胞对照组,只有RNAi组可检测到Bax基因的表达。两对照组细胞划痕损伤在48h内愈合,而RNAi组则不能修复。RNAi组软琼脂克隆形成能力明显低于两对照组。结论RhoC基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。
2008年08期 672-674页 [查看摘要][在线阅读][下载 101K] [下载次数：155 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 王建文;刘建巨;周文艳;刘宏宇;
目的构建原发性开角型青光眼(POAG)致病基因MYOC的真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达MYOC蛋白。方法用RT-PCR法扩增人眼组织(角膜缘)MYOC基因cDNA,纯化回收后,克隆入pGEM-T载体,再亚克隆入真核表达质粒pEGFP-N3,构建重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC,转染COS-7细胞,用荧光显微镜观察MYOC蛋白在COS-7细胞中的表达,Western blot分析MYOC蛋白分泌特点。结果经酶切和DNA测序鉴定,证实重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC构建正确,荧光显微镜观察MYOC蛋白能在COS-7细胞中表达,并且定位在细胞质中,而绿色荧光蛋白分布在整个细胞内。Western blot结果显示,MYOC蛋白能分泌到细胞外。结论已成功构建MYOC基因真核表达质粒,并能在COS-7细胞中表达MYOC蛋白,为进一步研究POAG发病机制奠定了基础。
2008年08期 675-678页 [查看摘要][在线阅读][下载 152K] [下载次数：77 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王爽;朱道银;帖儒修;李娜;王瑜伟;
目的表达鼠抑铁素2(lcn2)蛋白,并检测表达产物的生物学活性。方法从小鼠RAW264.7巨噬细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增lcn2基因片段,插入原核表达质粒pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。表达产物经His-tagin-gel stain鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析纯化,并检测其生物学活性。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,表明重组质粒pET-32a(+)-lcn2构建正确。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为21000,表达量占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白浓度为1.0g/L,并对大肠杆菌和乙型链球菌生长有一定的抑制作用。结论成功地在原核细胞中表达了重组lcn2蛋白,且表达的蛋白具有一定的抑菌作用。
2008年08期 679-682页 [查看摘要][在线阅读][下载 287K] [下载次数：66 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 杜红伟;张明;高航;吕晓艳;高鹏;李晶;
目的观察哺乳期大鼠大量摄入酒精对子代成年期胰岛素敏感性的影响。方法将Wistar雌鼠哺乳期酒精灌胃4g/kg·d,对照组给予等容积蒸馏水。子代出生后,每周测量体重1次,断乳后1周开始测量进食量;对第16周龄子代雄性鼠进行静脉葡萄糖耐量试验;Western blot检测骨骼肌细胞膜葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)含量;酶学法测定血浆和骨骼肌甘油三酯(TG)含量。结果哺乳期大鼠摄入酒精对后代生长发育无明显影响。与对照组比较,哺乳期大鼠摄入酒精的子代鼠16周龄时,葡萄糖耐量降低,血糖曲线下面积增加,胰岛素敏感指数(SI)、处置指数(DI)及葡萄糖耐量指数(KG)均明显降低,但葡萄糖效应指数(SG)与对照组比较,差异无显著意义,葡萄糖刺激的胰岛素快速反应分泌总量差异亦无显著意义;哺乳期大鼠摄入酒精的子代鼠,骨骼肌细胞膜GLUT4含量、血浆及骨骼肌TG含量与对照组比较,差异均无显著意义。结论哺乳期大鼠大量摄入酒精可引起后代成年期发生胰岛素抵抗,其发生机制与骨骼肌GLUT4转位及TG含量无关。
2008年08期 683-686页 [查看摘要][在线阅读][下载 157K] [下载次数：89 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 赵瑞利;韩文瑜;韩俊友;雷连成;孙长江;冯新;乔红伟;江丽娜;刘延麟;
目的分离纯化牛蛙皮肤抗菌肽,并检测其活性。方法通过刺激与浸提的方法,得到牛蛙皮肤抗菌肽粗提物,测定其抑菌活性及最低抑菌浓度。利用SephadexG-50凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化粗提物,用质谱仪测定多肽的相对分子质量及氨基酸序列,并进行活性检测。结果两种方法提取的牛蛙皮肤抗菌肽粗提物均具有较强的抑菌活性,纯化后的多肽相对分子质量约为4370,N-端含22个氨基酸,与其他两栖类来源的抗菌肽同源性较低。活性试验表明均无胰蛋白酶水解活性,存在一定的胰蛋白酶抑制剂活性,有轻微的溶血活性,不具有局部出血活性,具有抗凝和溶栓作用。结论已成功分离并纯化了1种新的牛蛙皮肤抗菌肽。
2008年08期 694-697页 [查看摘要][在线阅读][下载 122K] [下载次数：871 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：13 ] |[阅读次数：0 ] - 李坚;邱爱东;王玉龙;
目的合成整合素(Integrin)αvβ3拮抗剂-苯丁酸氮芥偶联毒素,并检测其体外抗肿瘤活性。方法化学合成In-tegrinαvβ3拮抗剂,并与苯丁酸氮芥通过酰胺键偶联,MTT法检测偶联毒素对人脐静脉内皮细胞ECV304和肝癌细胞HepG2的抑制作用。结果合成的偶联毒素经核磁共振和质谱分析鉴定,表明结构正确,纯度达90%以上,对HepG2细胞的抑制效果弱于苯丁酸氮芥,但对ECV304细胞的抑制特异性较好。结论Integrinαvβ3拮抗剂-苯丁酸氮芥偶联毒素可抑制HepG2和ECV304细胞的增殖,为癌症治疗提供了一个新途径。
2008年08期 698-700页 [查看摘要][在线阅读][下载 55K] [下载次数：179 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 张晴妮;徐骥;李飞;芮康宁;贾世香;杨子义;
目的制备重组小纤溶酶,并检测其生物学活性。方法将重组质粒pET11a-miniPlg转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达。收获菌体,提取包涵体,经复性、层析纯化、尿激酶激活,制备小纤溶酶。进行初步理化鉴定后,采用生色底物法测定其体外活性,采用动物模型进行体内溶栓试验,并与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行比较。结果小纤溶酶的表达量约占菌体总蛋白的30%～35%,纯化收率约为15%,得率为4.93mg/g菌体湿重,相对分子质量为38527,N-、C-端氨基酸序列与理论值一致。制备的小纤溶酶比活性为115IU/mg,动物模型溶栓试验中表现出良好的溶栓效果,对纤溶系统和凝血系统影响轻微。结论所制备的重组小纤溶酶具有良好的生物学活性,溶栓效果及安全性均优于rt-PA。
2008年08期 701-704页 [查看摘要][在线阅读][下载 176K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ]
- 孙培录;夏咸柱;侯小强;高玉伟;贺文琦;孙贺庭;王承宇;杨松涛;王铁成;黄耕;
目的建立一种快速鉴别流感病毒受体结合特性的方法。方法应用流式细胞仪技术,通过地高辛标记的植物凝集素DIG-SNA和DIG-MAA,检测正常鸡红细胞、绵羊红细胞和经α-2,3唾液酸酶处理的鸡红细胞表面受体。分别应用两种受体类型不同的红细胞进行微量血凝试验,检测流感病毒的受体结合特性,并检测醛化红细胞对其受体结合特性的影响。结果流式细胞检测结果表明,鸡红细胞表面既有SAα2,6Gal受体,也有SAα2,3Gal受体,绵羊红细胞表面只有SAα2,3Gal受体,处理后的鸡红细胞表面只有SAα2,6Gal受体。经分别检测人禽流感病毒毒株,证实该方法能快速准确地鉴别流感病毒的受体结合特性,醛化红细胞未影响其受体结合特性。结论已成功建立了流感病毒受体结合特性的鉴别方法。
2008年08期 713-716页 [查看摘要][在线阅读][下载 204K] [下载次数：469 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：8 ] |[阅读次数：0 ] - 罗辉武;向军俭;
目的利用麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体建立麻痹性贝类毒素GTX2,3直接竞争ELISA(dc-ELISA)检测方法。方法通过过氧化反应将GTX2,3与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。以兔抗小鼠IgG多抗为包被抗体,GTX2,3为竞争剂,与GTX2,3-HRP竞争结合GTX2,3单克隆抗体,初步建立检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的dc-ELISA,并用该方法检测GTX2,3单克隆抗体与C2毒素之间的交叉反应。结果直接ELISA检测证实GTX2,3与HRP偶联成功。dc-ELISA检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的灵敏度为1.5μg/ml,工作范围为1.5～40μg/ml,GTX2,3毒素与C2毒素无交叉反应。该方法具有良好的特异性。结论dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测。
2008年08期 717-719页 [查看摘要][在线阅读][下载 39K] [下载次数：195 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 陈彧;韩金祥;崔亚洲;
目的探讨基于ZipTipC18的肽段提取方法在疾病临床诊断中的应用价值。方法用基于ZipTipC18和磁珠的体液肽段提取方法分别提取正常胰液、胰腺癌胰液和正常血液中的肽段,进行体液肽表达谱的PMF分析,对所得数据进行标准化处理,对目的肽段进行TOF/TOF分析鉴定。结果通过质谱分析得到了反映样品蛋白构成的肽表达谱。基于ZipTipC18的肽段提取方法获得的数据准确、可靠,重复较好,通过TOF/TOF分析,血液样品中的肽段鉴定为fibrinogen α链前体。根据正常胰液与胰腺癌胰液的差异肽表达谱,可将癌症患者与正常对照者明显区分。结论基于ZipTipC18的肽段提取方法可作为疾病(尤其是癌症)的辅助诊断方法。
2008年08期 720-724页 [查看摘要][在线阅读][下载 812K] [下载次数：78 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 亓文骞;李相军;任立群;
目的制备氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),并检测其对血管平滑肌细胞(SMC)增殖能力的影响。方法肝素沉淀法提取LDL,Cu2+氧化法制备ox-LDL,MTT法测定其对Wistar大鼠血管SMC增殖能力的影响。结果LDL完全被氧化成ox-LDL SDS-PAGE显示,LDL相对分子质量降低;200mg/Lox-LDL可刺激体外培养的SMC增殖能力明显增强;ox-LDL浓度不低于600mg/L时,SMC增殖能力明显下降。结论成功制备了ox-LDL,一定浓度的ox-LDL可促进SMCs的增殖。
2008年08期 725-726+731页 [查看摘要][在线阅读][下载 45K] [下载次数：336 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ]