- 张秀香;袁子国;李景文;于慧;郭振南;赵艳;王洪预;王庆钰;
目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达。
2008年06期 449-451+456页 [查看摘要][在线阅读][下载 231K] [下载次数：146 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘汉平;方志正;
目的构建复合通用CD4+Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650bp左右的目的片段,插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应。结果SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Westernblot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1∶15758.65和1∶67558.81。结论已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制。
2008年06期 452-456页 [查看摘要][在线阅读][下载 290K] [下载次数：96 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 朱可彤;杜娟;王小丹;郭博;孔维;于湘晖;
目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。
2008年06期 457-459页 [查看摘要][在线阅读][下载 158K] [下载次数：162 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 陈晓琦;徐葛林;全家妩;
目的分析武汉地区人呼吸道合胞病毒(RSV)分离株的G蛋白基因的遗传特征。方法使用不同的特异性引物,对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3′末端第2个高变区的序列测定,并进行基因分型和基因亲缘关系分析。结果分离的9株RSV中,33.3%(3/9)为A亚型,属GA2基因型;66.7%(6/9)为B亚型,其中1株属于BA基因型,5株属于GB8基因型。9株RSVG蛋白与原型株核苷酸同源性为84.5%～99.0%,且与原型株相比,在205～230位氨基酸中有5～8个位点氨基酸变异,还存在糖基化位点的改变。结论2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链,A、B亚型共循环,B亚型是优势流行亚型;9株RSVG蛋白与原型比较,存在明显的差异。
2008年06期 460-462+470页 [查看摘要][在线阅读][下载 192K] [下载次数：83 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 王斌;李秋荣;刘放南;罗楠;李幼生;李宁;黎介寿;
目的从人的肠道中分离具有高黏附性能的益生乳酸菌,为其应用于临床研究提供依据。方法采用改良的LAMVAB选择性培养基,取肠黏膜活检标本进行分级分离。对分离的乳酸菌进行生理、生化鉴定和16SrRNA序列测定,并对其耐酸、耐胆盐特性、黏附性能以及抑菌特性等进行分析。结果从人肠黏膜活检标本中分离出1株乳酸菌L2,该菌能在改良的LAMVAB选择性培养基上生长,并能抵抗pH2.5的酸性环境和0.3%的高胆盐环境;体外黏附试验显示,该菌株具有较好的黏附性能,对人肠上皮样细胞Caco-2和大鼠小肠上皮细胞IEC-6的黏附指数分别达(595±125.76)/100cells和(538±65.2)/100cells,且黏附具有Ca2+依赖性。对大肠杆菌、铜绿假单胞菌等具有较强的抑制作用,对益生菌鼠李糖乳杆菌LGG和嗜酸乳杆菌L05013-12无抑制作用。该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。结论植物乳杆菌L2具有较好的黏附性能,且耐酸、耐胆盐性能以及抑菌特性均较佳,具备作为益生菌使用的潜能。
2008年06期 463-466+474页 [查看摘要][在线阅读][下载 297K] [下载次数：268 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：18 ] |[阅读次数：0 ] - 杨金环;查向东;方红;刘小强;屈满义;
目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPOThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右。随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。
2008年06期 467-470页 [查看摘要][在线阅读][下载 237K] [下载次数：76 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：14 ] |[阅读次数：0 ] - 郭德军;柳增善;潘风光;
目的利用毕赤酵母表达系统表达IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素,并检测其杀伤肿瘤细胞的活性。方法采用PCR技术,将目的基因IL-6(23)-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaBⅠ与NotⅠ位点,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,筛选Mut-型重组酵母;甲醇诱导表达,体外细胞试验检测其细胞毒性。结果获得12株Mut-重组酵母,其中8株具有细胞毒性,表达产物占上清液蛋白的9%～12.7%;15"l以上的表达产物在体外对SP2/0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性,对CK、HeLa和NIH/3T3细胞无明显影响。结论IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GS115中获得表达,并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性。
2008年06期 471-474页 [查看摘要][在线阅读][下载 203K] [下载次数：132 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 廖鹏;马青原;刘文森;万家余;邢丽杰;李吉平;高宏伟;
目的构建蓖麻毒素A链(RTA)和RTA-KEEL/KDEL基因表达载体,并检测重组蛋白的细胞毒性作用。方法用PCR法从蓖麻毒素基因组中扩增出RTA及RTA-KEEL/KDEL基因,连接T载体,测序正确后,定向插入质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RTA和pET-28a-RTA-KEEL/KDEL,转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果所表达的RTA及RTA-KEEL/KDEL非融合蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为31000,Westernblot分析具有反应原性,MTS法检测,RTA-KEEL/KDEL对CHO细胞具有比RTA更强的杀伤作用。结论已成功构建RTA和RTA-KEEL/KDEL表达载体,表达的重组蛋白具有生物学活性。
2008年06期 475-478页 [查看摘要][在线阅读][下载 209K] [下载次数：114 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 胡圣尧;聂志妍;王尊生;袁勤生;
目的表达并纯化重组蛹虫草超氧化物歧化酶脱辅基蛋白,并考查各种金属离子对其活性重建的作用。方法用不含Cu2+和Zn2+的培养基培养重组菌株,并表达重组蛋白,采用DEAE-FF和CM-52进行纯化;在脱辅基蛋白溶液中加入Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+或Ag+,测定SOD酶活力的变化。结果蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD在不含Cu2+和Zn2+的培养基中得到表达,纯化后的样品经SDS-PAGE分析,在相对分子质量17000处出现单一条带,经活性电泳分析无酶活力;脱辅基蛋白活性重建的最适宜Cu2+浓度为0.005mmol/L,但其紫外吸收图谱与天然SOD不同;0.1mmol/L的Mn2+、Mg2+、Ni2+、Ag+重建的酶活力远低于Cu2+重建的cm-SOD的酶活力。结论已成功表达并纯化了蛹虫草脱辅基Cu,Zn-SOD,各种金属离子只能有限地重建脱辅基Cu,Zn-SOD的活性。
2008年06期 479-482页 [查看摘要][在线阅读][下载 548K] [下载次数：142 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 郭海英;时成波;隋红;迟春萍;刘淑玲;张勇;郭凤云;郭立君;
目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。
2008年06期 483-485页 [查看摘要][在线阅读][下载 296K] [下载次数：71 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 蒋丽明;谭昌耀;胡波;袁进;金瓯;
目的研究同时表达SS1、SS2两种多肽(含前S1、前S2和S三种抗原成分)的重组毕赤酵母工程菌株(GS115-SS1S2)基因和表达的稳定性。方法取工程菌原代种子,连续传代至30代,提取15和30代工程菌基因组DNA,PCR分别扩增SS1和SS2基因片段,克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体中,进行基因序列测定。对第5、10、15、20、25、30代菌种进行培养和诱导,制备抗原粗提液,并用ELISA法检测其中的前S1、前S2和S的抗原性,同时用RPHA法检测抗原效价。结果第15和30代菌种基因组中SS1和SS2基因序列与原始菌种完全一致,第5、10、15、20、25、30代菌种表达产物的前S1、前S2和S抗原均为阳性;菌种传至20代,抗原滴度无变化,25代和30代菌种抗原滴度有一定程度下降。结论重组毕赤酵母工程菌GS115-SS1S2在20代传代过程中,基因和表达稳定性良好。
2008年06期 486-488页 [查看摘要][在线阅读][下载 87K] [下载次数：160 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ] - 朱文华;姜昌丽;张存;游彦杰;王伟华;刘艳;张珍;冉永刚;叶星明;李维娜;韩苇;张英起;
目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1∶10000,可与SP2/0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长。
2008年06期 489-492页 [查看摘要][在线阅读][下载 108K] [下载次数：112 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 栗俊杰;杨致邦;张任飞;周侠;夏丽君;
目的表达幽门螺杆菌hpaA基因的重组蛋白,并检测其抗原性和免疫原性。方法用PCR方法从H.pylori DNA中扩增hpaA基因片段,插入原核表达载体pQE-30,转化大肠杆菌DH5α,进行诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Ni2+-NTA树脂纯化后,用Westernblot鉴定其反应原性。用重组蛋白免疫家兔,检测其免疫原性。用重组蛋白免疫小鼠,分别检测胃黏膜、PP细胞悬液及小肠黏液中的IgG和sIgA的含量。结果重组表达质粒pQE30-hpaA构建正确,所得序列完整,插入的基因片段全长783bp,与基因文库中的hpaA基因同源性达97.3%。表达产物相对分子质量为30000,目的蛋白表达量占全菌总量的31.67%,主要存在于碎菌后上清中,纯度在90%以上。Westernblot显示该蛋白可与病人血清特异性结合,免疫血清能与重组蛋白反应,双扩散效价为1:16。小鼠体内IgG、IgA、sIgA含量明显高于PBS对照组。结论已获得高纯度的HpaA重组蛋白,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制幽门螺杆菌疫苗。
2008年06期 493-496页 [查看摘要][在线阅读][下载 246K] [下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：4 ] |[阅读次数：0 ] - 刘景春;邹文涛;何子毅;吴远军;车嘉琳;刘赴平;
目的对1份正反定型不符的献血者标本进行血清学及分子特性分析。方法采用吸收放散试验进行红细胞弱抗原检测,SSP-PCR方法进行基因分型,PCR产物克隆后进行测序分析。结果该标本血清学反应格局符合Ax亚型,分子生物学检测为A型。测序结果表明,Exon4含有2个连续碱基错义突变位点,分别为nt187G>A,nt188C>T,导致第63位氨基酸的改变(Arg63His)。结论该Ax亚型是由于Exon42个碱基突变,引起氨基酸的改变,导致糖基转移酶活性的降低,从而使红细胞上表达的A抗原大大减少。
2008年06期 497-499页 [查看摘要][在线阅读][下载 141K] [下载次数：42 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]