- 刘汉平;方志正;
目的构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序。方法由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测序。结果经PCR扩增出645bp的目的DNA片段。酶切鉴定筛选出8个阳性克隆,经测序获得一个序列完全正确的克隆。结论已成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,为研究表位疫苗和细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位。
2008年05期 353-355+359页 [查看摘要][在线阅读][下载 105K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 刘志贞;康慧芳;樊慧杰;王晓媛;杨利军;杨琦;牛勃;
目的研究蚯蚓组织中一种新型脱氧核糖核酸酶(EWD)的底物特异性及降解产物的特性。方法采用ZOR-BAX-Oligo柱-HPLC、琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法等技术,分析EWD对环状质粒DNA、线状λ-DNA、大肠杆菌基因组的降解作用,及对真核鲱精DNA、单链DNA等的降解中间产物和终产物的特性,并观察其对RNA的降解作用。结果EWD对这几种DNA均有降解作用,降解产物为较均一的、小于18bp的寡核苷酸。但EWD对RNA无降解作用。结论EWD为脱氧核糖核酸内切酶类。
2008年05期 356-359页 [查看摘要][在线阅读][下载 235K] [下载次数：152 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 金明兰;金宁一;鲁会军;马鸣潇;郑敏;金扩世;霍晓伟;计越;
目的构建重组口蹄疫鸡痘病毒,并检测其遗传稳定性和免疫原性。方法将口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1,并与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU加压筛选获得重组鸡痘病毒vUTAL3CP1。重组病毒在CEF中连续传30代,分别进行毒力和基因检测,并免疫BALB/c小鼠,检测特异性抗体和中和抗体。结果重组鸡痘病毒经RT-PCR可扩增出目的基因;特异性荧光抗体反应呈阳性;在CEF中连续传30代,毒力稳定,基因未发生缺失和变异;免疫小鼠能产生较高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体。结论已成功构建重组口蹄疫鸡痘病毒,且具有良好的遗传稳定性和免疫原性。
2008年05期 360-363+366页 [查看摘要][在线阅读][下载 161K] [下载次数：71 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 谢淑丽;陈志明;苏学今;孙梅;全成实;
目的构建靶向RhoC基因的RNA干扰(RNAi)载体,并研究RhoC基因沉默对肝癌细胞增殖的影响。方法将合成的寡核苷酸片段克隆入RNAi载体,并转染肝癌细胞,以沉默RhoC基因表达,RT-PCR检测基因抑制效果。绘制生长曲线,检测转染细胞的增殖情况,FCM检测细胞周期变化。结果构建的RNAi载体有效地抑制了肝癌细胞RhoC基因的表达,RhoC基因沉默显著地抑制肿瘤细胞增殖,增殖期细胞百分数显著下降,而静止期细胞百分数显著升高。结论RhoC基因沉默能够抑制肝癌细胞的增殖,为靶向RhoC的肿瘤基因治疗奠定了基础。
2008年05期 364-366页 [查看摘要][在线阅读][下载 117K] [下载次数：161 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：10 ] |[阅读次数：0 ] - 杜德伟;孙脊峰;吴学勤;李端;杨洁;李占亭;
目的构建含有TGF-βⅡ型受体(TGF-β R Ⅱ)的真核表达载体及针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒,并观察RNA干扰对TGF-β R Ⅱ表达的抑制作用。方法PCR方法扩增TGF-β R Ⅱ的cDNA序列,将全长的TGF-β R ⅡcDNA插入pcD-NA3.1中,构建TGF-β R Ⅱ的真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ,并检测其在293T细胞中的表达。根据TGF-β R Ⅱ的基因序列,设计针对TGF-β R Ⅱ的干扰RNA,构建针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ。脂质体介导质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ和pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ共转染293T细胞,Western blot法检测RNA干扰质粒的生物活性。结果真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ和RNA干扰质粒pSUPER-TGF-β R Ⅱ经酶切鉴定构建正确,测序结果显示未发生基因突变。间接免疫荧光检测pcDNA3.1-TGF-β R Ⅱ转染的293T细胞,可见绿色荧光。针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒明显抑制293T细胞内TGF-β R Ⅱ的表达。结论已成功构建了TGF-β R Ⅱ的真核表达载体及针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰质粒,为进一步研究针对TGF-β R Ⅱ的RNA干扰对肾纤维化的预防及治疗作用奠定了基础。
2008年05期 367-370页 [查看摘要][在线阅读][下载 371K] [下载次数：260 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 霍晓伟;金宁一;鲁会军;马鸣潇;牟伟峰;
目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。
2008年05期 371-373+377页 [查看摘要][在线阅读][下载 193K] [下载次数：114 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 迟春萍;隋红;李雨桐;薛向光;王志武;牛灵;刘畅;王艳芳;吴晓娟;郭立君;盛军;李校堃;
目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。
2008年05期 374-377页 [查看摘要][在线阅读][下载 133K] [下载次数：248 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：7 ] |[阅读次数：0 ] - 孙昱;王文加;杨海山;柳林;
目的研究兔脂肪间充质干细胞体外诱导分化为具有胰岛素分泌功能的细胞的可能性。方法采用贴壁法分离兔脂肪间充质干细胞,培养、传代后,以胰高糖素样多肽(GLP-1)和尼克酰胺作为诱导剂进行诱导分化。对诱导后的细胞进行双硫腙染色及葡萄糖刺激胰岛素分泌试验,ELISA法检测胰岛素含量。结果细胞诱导后逐渐聚集成细胞团,双硫腙染色呈砖红色,诱导后第14天培养液中可检测到胰岛素,第21天浓度较14d增高,高糖组[(21.5±1.6)μIU/ml]比低糖组[(18.1±2.5)μIU/ml]略高,且差异有显著意义。结论兔脂肪间充质干细胞在体外一定诱导条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。
2008年05期 378-380+384页 [查看摘要][在线阅读][下载 147K] [下载次数：110 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：6 ] |[阅读次数：0 ] - 马秋平;白坚石;
目的以双向凝胶电泳(2-DE)方法分析不同型别正常人红细胞及细胞膜的蛋白质组图谱。方法提取不同型别的正常人红细胞全细胞蛋白和膜蛋白,以2-DE进行蛋白质的分离,银染显示电泳分离结果,ImageScanner扫描仪扫描并获得图像,以图像分析软件ImageMaster 2D Platinum进行结果分析和比较。结果在不同型别红细胞的全细胞蛋白谱中,有5个蛋白斑点出现表达差异。蛋白硫脲细胞膜处理法与SDS细胞膜处理法获得的红细胞膜蛋白2-DE图谱比较,前者获得的蛋白斑点数增多。结论2-DE有助于分析红细胞膜蛋白质组的表达差异。采用去除膜脂类的样品处理方法,可以提高红细胞2-DE图谱的分辨率。
2008年05期 381-384页 [查看摘要][在线阅读][下载 188K] [下载次数：208 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ] - 方爱平;任莉莉;齐晖;文锦丽;王英兰;
目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。
2008年05期 385-388页 [查看摘要][在线阅读][下载 186K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴勇;吴远军;陈宝婵;刘艳;
目的对Am亚型患者的血型进行血清学鉴定,并为其输血选择适合的血液成分。方法对1名ABO正反定型不相符患者,用抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB和抗-H单抗检测红细胞ABH抗原;A、B、O型红细胞与血浆反应检测ABO血型抗体及不规则抗体;吸收放散试验检测红细胞弱抗原;中和抑制试验检测唾液中ABH血型物质。根据患者血型血清学检测结果,选择相容血液成分进行输血。结果该患者符合Am亚型的血型血清学特征,输入O型少白细胞红细胞6U,A型单采血小板1治疗量后,均能达到预期疗效,无不良反应。输血后3个月的血型血清学检测结果与输血前完全一致。结论ABO血型鉴定时坚持正、反定型,可避免将Am亚型误定为O型,对Am亚型的准确鉴定有赖于多种血型血清学试验。Am亚型患者输血时可选择O型红细胞、A型血小板、A型或AB型血浆。
2008年05期 389-390+394页 [查看摘要][在线阅读][下载 31K] [下载次数：78 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：5 ] |[阅读次数：0 ]
- 刘来成;王淑玲;范雄林;付瑞玲;刘岚;卢贤瑜;
目的检测结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫和体液免疫应答水平。方法将BALB/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,分别进行免疫,免疫8周后处死小鼠,分离血清,ELISA间接法测定血清特异性抗PPDIgG抗体的水平,流式细胞分析仪检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。脾淋巴细胞经体外培养、PPD刺激后,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数,ELISA法检测培养上清液中IFN-γ和IL-4的水平。结果H37Ra免疫小鼠血清中抗PPDIgG抗体、脾脏CD3+T细胞和CD4+T细胞的百分率、脾淋巴细胞刺激指数、IFN-γ和IL-4水平均显著高于NS对照组,但与BCG组差异无显著意义。各组间脾脏CD8+T细胞、CD4+T/CD8+T比值差异均无显著意义。结论H37Ra免疫小鼠后,可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答,有望成为结核疫苗的候选抗原。
2008年05期 391-394页 [查看摘要][在线阅读][下载 45K] [下载次数：154 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：11 ] |[阅读次数：0 ] - 魏晓露;刘婧;高菁霞;张新文;陈俊英;黄秋香;何香莲;张云昆;余磊;姜述德;廖国阳;李映波;
目的观察二乙烯亚胺(BEI)对流感病毒的灭活效果。方法分别使用甲醛和BEI对流感病毒进行灭活试验,通过血凝试验检测二者灭活效果,并确定各自最佳灭活时间。用灭活的病毒液免疫小鼠,检测其抗原性,并用RT-PCR方法分析灭活病毒基因组的完整性。以裂解剂TritonX-100裂解病毒后,分别加入甲醛和BEI灭活,采用单向免疫扩散法检测灭活不同时间病毒液的HA含量。结果BEI灭活36h可将病毒完全灭活;BEI灭活的病毒免疫小鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体;BEI灭活病毒液经RT-PCR,不能扩增出病毒基因;BEI灭活病毒的HA平均含量比甲醛灭活病毒的HA平均含量略高。结论BEI在灭活流感病毒感染性的同时,能够灭活病毒基因,并较好地保持病毒的抗原性。
2008年05期 395-397页 [查看摘要][在线阅读][下载 118K] [下载次数：562 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：15 ] |[阅读次数：0 ] - 刘延庆;刘晋平;殷国荣;马晓明;孟晓丽;刘红丽;
目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)经滴鼻、灌胃和皮下注射3种途径免疫小鼠诱导的免疫应答。方法5~6周龄BALB/c小鼠32只,随机分为4组,分别以20μgSTAg滴鼻、灌胃或皮下注射免疫小鼠2次,间隔2周,对照组不作处理。末次免疫后14d脱颈椎处死小鼠,分离脾淋巴细胞和肠上皮内淋巴细胞(IELs)并计数,ELISA法测定血清、肠冲洗液中的弓形虫特异性抗体。结果滴鼻组和皮下注射组的脾淋巴细胞数量高于灌胃组和对照组,灌胃组与对照组相近。滴鼻组的IELs数量高于皮下注射组、灌胃组和对照组,皮下注射组和灌胃组与对照组一致。皮下注射组的血清IgG水平高于滴鼻组、灌胃组和对照组,滴鼻组略高于灌胃组和对照组,但差异无显著意义。滴鼻组的小肠冲洗液sIgA水平高于皮下注射组、灌胃组和对照组,皮下注射注射组和灌胃组略高于对照组,差异无显著意义。结论20μgSTAg滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答优于灌胃和皮下注射;皮下注射免疫小鼠诱导的血清IgG抗体水平高于滴鼻和灌胃,但其未能诱导黏膜免疫应答。
2008年05期 398-400页 [查看摘要][在线阅读][下载 37K] [下载次数：119 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：17 ] |[阅读次数：0 ] - 冷梅;闫刚;迟春萍;韩顺子;吴晓娟;赵大鹏;汪春义;郑全莉;李鑫;李雨桐;张秀霞;姜崴;
目的构建乙型肝炎表面抗原基因(HBsAg)与GM-CSF基因的双表达载体,提高乙肝病毒DNA疫苗的免疫效果。方法将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将HBsAg基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点处,构建双表达载体pHIG。将pHIG转染到COS-7细胞中,检测瞬时表达情况,并用双表达质粒pHIG免疫BALB/c小鼠,检测免疫后小鼠血清中抗-HBs及其脾脏T细胞表面CD4+、CD8+分子的数量。结果在转染pHIG质粒的COS-7细胞上清液中有HBsAg的表达,pHIG双表达质粒组比pVAX/HBs组抗体产生时间提前2周,抗体阳转率提高2倍,小鼠脾脏T细胞表面CD4+分子数量及CD4+/CD8+值均高于pVAX/HBs组。结论HBsAg与GM-CSF基因双表达质粒能引起小鼠特异性免疫应答,并可提高免疫效果。
2008年05期 401-404页 [查看摘要][在线阅读][下载 122K] [下载次数：103 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]
- 孙红;万忠海;张国利;吴广谋;朱平;岳玉环;
目的构建抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单链抗体(ScFv)的表达载体,并在大肠肝菌中表达。方法从分泌ICAM-1单抗的杂交瘤细胞中提取RNA,用RT-PCR扩增抗体VH和VL基因,重叠延伸PCR扩增人ICAM-1-ScFv基因,将其连接到pET-22b(+)载体上,转化大肠杆菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,表达产物纯化及复性后,检测特异性及活性。结果序列分析表明抗ICAM-1 ScFv基因全长为744bp,编码247个氨基酸,其中含357bp的VH基因片段和342bp的VL基因片段。表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的32%。经变性和复性后,纯度达80%以上,复性率达25%。Western blot和ELISA检测,ScFv均可与ICAM-1抗原特异性结合。细胞黏附试验表明ScFv能抑制ICAM-1与HSB2细胞间的黏附,其作用稍弱于亲本mAb。结论已成功构建了抗人ICAM-1的ScFv表达载体,其表达产物具有抗体特异性和活性。
2008年05期 405-409页 [查看摘要][在线阅读][下载 546K] [下载次数：158 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：0 ] - 周辉;徐葛林;严家新;盛柏杨;公衍道;
目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。
2008年05期 410-413页 [查看摘要][在线阅读][下载 73K] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：0 ] - 裴瑾;赵立欣;姜晶;睢大员;于晓风;王班;金磊;
目的观察外用重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)凝胶对实验性动物烧烫伤的治疗作用。方法采用电烙铁方法建立实验性大鼠烫伤创面,烫伤部位分别采用外用rhGM-CSF凝胶基质、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)喷雾剂、外用rhGM-CSF凝胶高(20μg/cm2)、低(5μg/cm2)剂量进行治疗,观察外用rhGM-CSF凝胶对烫伤创面的治疗作用,包括烫伤皮肤的病理学检查、烫伤创面的愈合情况、烫伤创面的感染情况及烫伤动物的死亡情况。采用凝固气油烧灼建立实验性小鼠Ⅲ°烧伤模型,烧伤部位分别采用rhGM-CSF凝胶基质、bFGF喷雾剂和外用rhGM-CSF凝胶进行治疗,观察小鼠死亡数量、感染情况及创面愈合后生毛时间。结果与凝胶基质对照组比较,外用rhGM-CSF凝胶高、低剂量治疗大鼠烫伤后的皮肤愈合时间明显缩短。病理检查结果显示,外用rhGM-CSF凝胶高、低剂量治疗大鼠烫伤创面的愈合程度明显优于凝胶基质对照组。外用rhGM-CSF凝胶对小鼠Ⅲ°烧伤具有保护和抗感染作用。烫伤创面愈合后生毛时间明显短于凝胶基质对照组。结论外用rhGM-CSF凝胶对实验性动物烧烫伤具有较好的治疗效果。
2008年05期 414-416页 [查看摘要][在线阅读][下载 425K] [下载次数：295 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：19 ] |[阅读次数：0 ] - 程大也;郝一文;陈海伟;
目的探讨不同血小板保存液对血小板体外保存期间质量的影响。方法分别应用3种保存液(血浆、Seto和A)保存浓缩血小板,在保存的第1、5、7和10天,进行血小板计数,并检测平均血小板体积(MPV)、胶原诱导的聚集反应、pH和二氧化碳分压(pCO2)、血小板活化率及葡萄糖消耗和乳酸生成。结果A保存液组血小板溶液的pH和pCO2比血浆组和Seto保存液组稳定。MPV3组比较差异较小。血浆组和Seto保存液组血小板活化率随保存时间延长而上升,而A保存液组比较稳定。血浆组和Seto保存液组血小板聚集率随保存时间延长而大幅度下降,A保存液组保持在70%左右。A保存液组葡萄糖消耗和乳酸生成幅度低于血浆组和Seto保存液组。结论A保存液在维持血小板体外保存期间质量的作用上优于血浆和Seto保存液。
2008年05期 417-420页 [查看摘要][在线阅读][下载 43K] [下载次数：129 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：0 ]