四川地区宫颈癌患者组织中部分高危HPV亚型感染及E6基因序列分析

目的调查四川地区宫颈癌患者组织中高危人乳头瘤病毒(HPV)33、52和58亚型的感染状况及E6基因突变特性,为制备适合中国人群的HPV疫苗提供流行病学资料。方法采用PCR技术,并结合基因测序分析。结果对四川地区2003~2004年60份宫颈癌患者癌组织DNA进行HPV检测,获得HPV52和HPV58亚型各4份,检出率为6·7%;HPV33亚型1份,检出率为1·7%。对所获得的各份HPV33、52和58E6基因测序,均有碱基突变。结论HPV52型感染率在四川地区相对较高。与GenBank标准株相比,四川地区发现的HPV33和HPV52E6基因有多处突变,与日本发现的HPV33和HPV52突变株相近。

转基因人参细胞中HBsAg的表达及稳定性研究

目的对转基因人参CS83细胞系表达HBsAg的特异性、稳定性及表达效率进行分析。方法提取CS83细胞表达蛋白,分别以Lowry法和ELISA法检测总蛋白含量和HBsAg含量,SDS-PAGE和Western blot分析表达蛋白的HBsAg特异性。采用冷冻干燥、干燥和低温处理方法检测CS83细胞中HBsAg的稳定性。结果CS83细胞表达产物中总蛋白含量为2·024mg/g,HBsAg含量为504ng/g,占总蛋白含量的0·025%。表达的目的蛋白相对分子质量约为25000,具有HBsAg特异性。经不同方法处理后的保存结果表明,冻干保存稳定性最好。结论所建立的CS83细胞系能够稳定地表达特异性HBsAg。

产气荚膜梭菌α-β_2-β_1融合基因的构建及表达

目的构建产气荚膜梭菌α-β2-β1融合蛋白基因表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法利用PCR技术,从含α毒素基因的质粒pXCPA02中扩增出α毒素基因,经NcoⅠ酶切,回收0·95kb的α基因片段,再与经NcoⅠ酶切并含融合基因β1-β2的质粒pXETB1B2连接,获得重组质粒pXETAB2B1,经NcoⅠ、BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定,并对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒pXETAB2B1含有α-β2-β1融合基因。表达产物相对分子质量约为95000,并可被特异性抗体识别。结论已获得高效表达α-β2-β1的重组菌株。

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。

结核分枝杆菌RD1区重组11 kD蛋白的克隆表达及效力

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区11kD蛋白,并检测表达产物的效力。方法构建11kD蛋白编码基因原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,离子层析柱分离纯化重组蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌11kD蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白占总菌体蛋白的33%以上,纯化后纯度达95%以上,并可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,5μg/ml11kD蛋白的效力与50IU/ml TB-PPD相当。结论重组11kD蛋白已在大肠杆菌中成功表达,并有望成为结核病皮试鉴别诊断用新试剂。

社区人群乙型肝炎疫苗接种状况及影响因素调查

重组人红细胞生成素二聚体工程细胞的建立

目的建立重组人红细胞生成素二聚体工程细胞株。方法用重组人红细胞生成素二聚体表达载体转染COS-7细胞,通过dot blot进行检定。然后对CHO-dhfr-细胞进行稳定转染,再经过稀释克隆和MTX的加压扩增,筛选二聚体工程细胞株并进行传代及无血清培养基培养、目的蛋白纯化及检测。结果瞬时转染70h细胞有目的蛋白表达。稳定转染后选取表达量最高的细胞株为工程细胞株。该细胞株连续传15代及经无血清培养基培养,目的蛋白表达量均无明显下降。所表达的目的蛋白相对分子质量为70000,并具有高度特异性。结论已获得稳定高效表达重组人红细胞生成素二聚体的工程细胞株。

乙型肝炎病毒X基因DNA竞争子的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒X基因DNA(xDNA)竞争子L180,为竞争PCR定量分析xDNA打下基础。方法以扩增的xDNA片段为模板,用引物1434和Lx PCR扩增竞争子DNA,并将扩增产物克隆到pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,酶切鉴定和测序,筛选阳性竞争子质粒,并建立竞争PCR定量分析xDNA的方法。结果所构建xDNA竞争子L180,经测序及PCR定量分析证实,PCR扩增的产物即为目的xDNA。初步建立了竞争PCR定量分析xDNA的方法。结论已成功构建乙肝病毒xDNA竞争子。

黄热疫苗病毒17D株在Vero细胞上的适应性传代

目的建立黄热疫苗病毒17D株的Vero细胞适应株。方法将2批鸡胚黄热疫苗病毒在Vero细胞上进行2次蚀斑筛选,并连续传代培养,然后对获得的4株Vero细胞适应株病毒YFV-Vero(5)-A1、YFV-Vero(5)-A2、YFV-Vero(5)-B1和YFV-Vero(5)-B2进行稳定性和免疫原性检测。结果4株Vero细胞适应株病毒可被黄热病毒(17D)猴免疫血清中和。在传代过程中,不同代次的病毒滴度稳定在6·90LgPFU/ml以上,高峰病变出现时间为5~7d。家兔和小鼠的免疫血清中和抗体效价分别为1∶640~1∶5120和1∶640~1∶2560。结论4株Vero细胞适应株病毒生物学性状稳定,免疫原性良好。

黄芪多糖对人用狂犬病疫苗免疫原性的影响

目的研究黄芪多糖对狂犬病疫苗免疫应答的影响。方法将BALB/c小鼠和昆明小鼠各自随机分为2组,即试验组与对照组,分别于0、7d接种冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。对照组疫苗用灭菌注射用水稀释,试验组疫苗用10%黄芪多糖(APS)溶液稀释,每只腹腔免疫0·5ml。BALB/c小鼠于15d无菌取脾,进行淋巴细胞转化实验;昆明小鼠在免疫前和第1针免疫后4、7、14、30、45和60d眶静脉采血,分别进行外周血淋巴细胞CTL试验和小鼠中和抗体水平测定。结果试验组疫苗诱导小鼠产生的中和抗体和细胞免疫水平均高于对照组疫苗,二者差异有显著意义。结论黄芪多糖能提高狂犬病疫苗的免疫原性。

天花疫苗的规模化制备

目的建立大规模制备天花疫苗的方法。方法用SPF鸡胚细胞培养痘苗病毒,经细胞破碎、膜过滤提取痘苗病毒,加保护剂制得天花疫苗。结果疫苗经检测,动物免疫效果和疫苗稳定性良好。结论此方法可以用于大规模制备天花疫苗,疫苗质量符合1979版《中国生物制品规程》要求。

重组人血白蛋白与小分子药物结合功能研究

目的研究重组人血白蛋白与小分子药物的结合功能。方法在366nm下检测地西泮与人血白蛋白结合前后吸收值的变化,计算二者的结合常数;华法令与人血白蛋白结合后,用SephadexG-25HPLC柱进行分离,对游离华法令和二者结合产物分别积分,得到华法令与人血白蛋白的结合率。结果重组人血白蛋白与地西泮的结合常数为14·68mol Diaze-pam/mol rHSA,天然人血白蛋白与地西泮结合常数为12·82mol Diazepam/mol HSA。重组人血白蛋白中华法令的结合率为8·69%,而天然人血白蛋白中华法令的结合率为6·73%。结论重组人血白蛋白与天然人血白蛋白小分子药物结合功能基本一致。

重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析

目的对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子(rhALR)进行分离纯化及生物学活性分析。方法以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30780·522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致。Western blot证实rhALR正确表达,等电点5·85~6·85,氨基酸含量与理论值基本符合。动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性。结论经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性。

乙型脑炎病毒抗原定量检测试剂的研制

目的制备酶联免疫乙型脑炎病毒抗原定量检测试剂,用于乙型脑炎灭活疫苗中抗原定量检测。方法分别用2株杂交瘤细胞分泌的抗乙型脑炎病毒单克隆抗体作为包被和标记物,配以辅助试剂,建立酶联免疫检测系统,用经标化的乙型脑炎疫苗参考品绘制定量标准曲线,对试剂各项技术指标进行验证。结果试剂对乙型脑炎病毒抗原的最佳定量范围是0·131~0·666ELISA单位(EU/ml),标准曲线相关系数r=0·996,平均变异系数CV小于10%。与NIH法测定结果相比较,相关有非常显著意义(P<0·01)。对2批乙型脑炎疫苗9次测定,变异系数分别为2·7%和4·4%。结论试剂的精密性和准确度高,特异性和稳定性可靠,可用于乙型脑炎疫苗中的抗原定量检测。

软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较

目的比较体外软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的敏感性及相关性。方法用软琼脂克隆法检测不同种类、不同来源的细胞的致瘤性,并与裸鼠体内接种法的结果进行比较。结果不同的细胞在体外软琼脂中形成细胞集落的能力及集落形态明显不同。肿瘤细胞在体外可形成肉眼可见的细胞集落,而人二倍体细胞及组织工程用细胞在体外不形成或仅形成极少的细胞集落克隆,其集落形成率与细胞代次没有相关性,在裸鼠体内亦不形成瘤。重组CHO细胞经过遗传改造后,有的在裸鼠体内的致瘤性减弱,但体外软琼脂克隆行为没有发生明显改变。从128至169代次的Vero细胞均可在体外软琼脂中形成不同的细胞集落克隆,高代次细胞的集落形成率明显高于低代次细胞,但所有检测代次的细胞在裸鼠体内均未形成瘤。结论用软琼脂克隆法检测细胞的致瘤性与裸鼠体内接种法不仅具有良好的相关性,而且敏感性高于裸鼠体内接种法。

食管癌细胞中热休克蛋白70-多肽复合物的分离

目的分离纯化癌细胞中热休克蛋白70(HSP70)-多肽复合物。方法以食管癌组织为材料,通过一系列的层析柱(ConA-Sepharose、ADP-Agarose、MonoQ及HSP70抗体亲和层析柱)进行分离及纯化。结果所分离纯化的HSP70-多肽复合物相对分子质量与预期相符。结论为提取肿瘤HSP70-多肽复合物提供了具体方法,并为研制多肽疫苗奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位特异性抗体检测方法的建立与评价

目的建立并评价幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)特异性抗体的检测方法。方法应用纯化的重组HpUreB作为包被抗原,建立检测HpUreB特异性抗体的ELISA间接法。以Hp抗体Western blot检测作为“金标准”,评价所建立方法的真实性和可靠性。结果检测血清特异性IgG的灵敏度为100·0%,特异度为97·7%,阳性预测值为97·2%,阴性预测值为100·0%,约登指数为0·977,符合率为98·7%,试验的一致率为98·5%;检测血清中总的特异性Ig灵敏度为97·1%,特异度为95·3%,阳性预测值为94·4%,阴性预测值为97·6%,约登指数为0·925,符合率为96·2%,试验的一致率为97·8%;检测唾液中特异性sIgA的灵敏度为96·2%,特异度为94·5%,阳性预测值为89·3%,阴性预测值为98·1%,约登指数为0·907,符合率为95·1%,试验的一致率为97·5%;检测粪便标本中的特异性sIgA的灵敏度为92·0%,特异度为90·2%,阳性预测值为85·2%,阴性预测值为94·9%,约登指数为0·822,符合率为90·9%,试验的一致率为98·6%,CV值均小于15%。结论该检测方法真实性、可靠性、重复性良好,能满足临床标本检测的要求。

碘化钾与酚/氯仿提取外周血基因组DNA方法的比较

目的建立碘化钾快速提取外周血基因组DNA的方法。方法采用碘化钾法和酚/氯仿提取法,直接从人外周血中提取基因组DNA,并以此为模板,进行人类生长激素(HGH)基因片段的扩增及鉴定。结果此方法提取的DNA量大,DNA体外扩增结果稳定。结论该方法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备。

细菌生物膜酶学消解的新方法

中国国际生物制药研讨会征文通知

乙型肝炎人免疫球蛋白的应用研究

本文就乙型肝炎免疫球蛋白应用效果、作用机理及应用中存在的问题等作了全面综述。

世界卫生组织乙型脑炎灭活疫苗质量控制与规程修订研讨会