从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体

目的　应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法　用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv ,并进行基因序列测定。结果　所获氨基酸序列经blast数据库搜索 ,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性最高 ( 82 % )。经检索kabat数据库 ,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型。结论　从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体 ,对狂犬病毒的预防具有重要意义

关于统计学符号规范化要求

重组人白细胞介素-10融合表达载体的构建及其在BL21(DE3)pLysE细菌细胞中的表达

目的　构建重组人白细胞介素 10 (recombinanthumaninterleukin 10 ,rhIL 10 )融合蛋白的表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法　应用RT PCR方法扩增IL 10基因 ,克隆PCR产物 ,构建PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10重组质粒 ,以AppiedBiosystems 370 0DNA分析仪进行分析。构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞 ,经 12 %SDS PAGE鉴定融合表达蛋白。结果　PCRR○T7/NT TOPOR○ 质粒已载入rhIL 10基因 ,其序列与理论设计完全一致 ,表达质粒在BL2 1(DE3)pLysE中得到高效表达 ,产物主要以包涵体形式存在。结论　已成功构建重组PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10质粒载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞内高效表达

重组人载脂蛋白A-I_((米兰变体))的复性及纯化

目的　从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法　包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果　经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论　本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 ,并且有望放大至工业生产规模

生物素标记UTP及温度值对HCV细胞外聚合酶分子复制模型的影响

目的　研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的生物素标记UTP浓度及温度值 ,为筛选药物创造条件。方法　使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体pET 30a NS5b。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2十 金属离子螯和亲和层析将其纯化 ,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究。利用 96孔DNA BAND培养板 ,建立生物素标记检测HCVNS5b聚合酶活性的模型。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,已得到相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达的融合蛋白 (相对分子质量6 5 0 0 0 ) ,纯度大于 92 .83%HCV聚合酶活性集团完整。建立了细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的最佳生物素标记UTP浓度及温度值。结论　HCV聚合酶得到高效表达和有效纯化 ,以及HCV聚合酶作用模板及温度的最佳条件分别为 0 .5mmol/L及 37℃。

成年SPF鸡胃肠道中芽胞杆菌的分离与部分生物学特性鉴定

目的　鉴定从SPF鸡分离出的芽胞杆菌的生物学特性。方法　从成年SPF鸡胃肠道的不同部位选择性分离 13株芽胞杆菌 ,并进行生物学特性检测。结果　 ( 1)所有菌株均能在含 5 %、10 %和 15 %NaCl的LB平板上生长 ,其中 11株能在含 6 %NaCl的LB平板上生长 ,7株能在含 7%NaCl的LB平板上生长。 ( 2 ) 2株能在pH 4 0的LB平板上生长 ,8株菌能在pH 5 0生长 ;所有菌株均能在pH 6 0～ 10生长 ,其中 12株能在pH 11生长 ,11株能在pH 12生长 ,而不能在pH 13～ 14生长。 ( 3)所有菌株在 75℃水浴中均能活存 2～ 5h ;11株能活存 10h ,9株能活存2 7h。所有菌株在 10 0℃水浴中加温 ,均能活存 0 5～ 2h ,其中 11株能活存长达 3h。 ( 4 )所有菌株在pH 4 0和pH11 0的LB培养基中均能存活半年以上 ,在pH 2 0和 13 0环境中能存活 1周和 3周以上。 ( 5 )菌体以沸石粉做载体常温保存 ,1年之内含量基本不变。 ( 6 )所有菌株均具有蜡样芽胞杆菌的特性。 ( 7)所有菌株对链霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素均敏感 ,对青霉素、土霉素和黄胺药均有抗性。结论　所有菌株均有望成为制备微生态制剂的候选菌株。

甲型肝炎病毒恒河猴模型的评估

目的　对国产恒河猴作为甲型肝炎病毒 (HAV)的动物模型做出全面评估。方法　用HAV野型株和H2株减毒HAV感染恒河猴 ,检测分析猴体的各种反应。结果　 14只恒河猴经 4株野型病毒感染后 ,全部血清抗体阳转 ,效价为 1∶2～ 1∶12 80 ,13只猴 ( 92 .9% )的血清酶异常升高和粪便排毒 ,2只猴 ( 14 .3% )有肝脏组织病理学极轻度改变 ;35 2只恒河猴分组接种 6 8批H2株及其子代病毒后 ,血清抗体阳转率为 99.7% ,血清酶异常升高率为2 .8% ,粪便排毒率为 5 8.3% ( 14 / 2 4 ) ,无肝脏组织病理学变化。结论　国产恒河猴是HAV的敏感动物 ,其ALT等血清酶指标能有效反映HAV的强毒或弱毒性质 ,可作为实验动物用于监测甲肝减毒活疫苗株的残余毒力

细菌多糖疫苗苯酚污染的分析及其检测方法

目的　确定细菌多糖疫苗苯酚污染及其质量控制方法。方法　采用分光光度法 ,改良Lowry氏标准加入法和HPLC法。结果　正常的脑膜炎球菌多糖在 2 6 0nm波长附近有一个最大吸收峰λmax( 2 6 0nm) ,而苯酚的特征吸收波长为λmax( 2 70nm) ;5批正常的脑膜炎球菌多糖A2 60 /A2 70 值在 1 0 7～ 1 12之间。当正常多糖原液有苯酚污染时 ,最大吸收波长红移 ( 2 6 0nm 2 70nm) ,导致A2 60 /A2 70 值由大于 1变为小于 1。当苯酚增加到 2 0 μg/ml时 ,A2 60 /A2 70 降至 0 88,纯的苯酚为 0 6 2 ;采用内标加入法定量测定出伤寒Vi多糖残留苯酚含量为 0 10 1μg/ml;HPLC法定量测定 1型肺炎球菌多糖、Hib多糖和卡介菌多糖核酸样品中的苯酚含量分别为 0 2 8、0 96和 0 6 3μg/ml。 结论　①多糖原液的A2 60 /A2 70 值可判断多糖原液是否被苯酚污染。当A2 60 >A2 70 或A2 60 /A2 70 =1.1(或 >1.0 7)时为正常 ,无苯酚污染或苯酚污染可接受 ;当A2 60 =A2 70 或A2 60 /A2 70 =1时为介于正常和不正常之间 ;当A2 60 <A2 70 或A2 60 /A2 70 =0 .9或以下时为不正常或有苯酚的污染。②内标加入法可定量测定细菌多糖中残留苯酚的含量。③HPLC法亦可精确地测定细菌多糖中残留苯酚的含量

凋亡抑制因子survivin在喉鳞癌中表达及其临床意义

目的　探讨凋亡抑制因子survivin在喉鳞癌中的表达及临床意义。方法　应用免疫组化SABC方法检测 5 4例喉鳞癌手术切除标本石蜡切片组织中survivin的表达 ,并以 10例声带息肉组织为对照。结果　survivin在声带息肉中不表达 ;在 5 4例喉鳞癌中 ,38例 ( 70 .4 % )表达阳性 ;survivin阳性表达率与喉癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分型无相关性 (P >0 .0 5 ) ,与喉癌临床分期、组织学分级、淋巴结转移呈正相关 (P <0 .0 5 )。结论　凋亡抑制因子survivin的异常表达所引起的凋亡抑制与喉鳞癌的发生发展相关 ,可作为肿瘤诊断、预后和治疗的一个新指标。

双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)的纯化工艺

目的　研究肾综合征出血热抗原的纯化工艺。方法　用Vero细胞繁殖肾综合征出血热病毒 ,经过灭活、浓缩 ,Sepharose 4FF凝胶过滤纯化。结果　用Sepharose 4FF柱层析纯化时 ,2 80nm监测收集到 3个吸收峰 ,其中第 1峰为抗原峰 ,将第 1峰稀释配制后进行动物实验 ,表明按照该工艺制备的Vero细胞纯化疫苗安全有效。结论　本研究为肾综合征出血热纯化疫苗的研制奠定了基础。

免疫毒素研究及临床应用进展 (二)临床研究

高致病性禽流感及其公共卫生学

禽流感的暴发和流行主要是由高致病性的H5和H7亚型AIV引起的。近年来高致病性禽流感的先后暴发和流行 ,特别是出现有人因感染而死亡的病例 ,更突出地显示了禽流感特别是高致病性禽流感的公共卫生学意义。对高致病性禽流感的流行病学、分子生物学等的研究为其预防和控制奠定了坚实的基础

我国重组(CHO细胞)乙肝疫苗免疫预防效果已达世界先进水平