- 刘煜菡;张名;许丹菡;郭伟;冯昌增;徐丽兰;马绍辉;
目的 比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒（enterovirus,EV）分离培养的敏感性，以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法 收集2019年昆明市某医院确诊手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）患者粪便样本60份，分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV，并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对，鉴定EV基因型。结果 共分离获得112株EV，分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论 RD细胞对大部分EV均敏感，KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。
2024年08期 v.37 917-920页 [查看摘要][在线阅读][下载 976K] [下载次数：55 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：7 ] - 阮朝列;刘伯川;雍国胜;施锦丽;鲍晓林;刘瑶;李卫东;周健;
目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养，建立悬浮细胞系，并进行检定，以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础。方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞，命名为MDCK-S细胞，进行18S及物种特异性PCR鉴定。将MDCK-S细胞传代至33代，作为主代细胞库（master cell bank,MCB）；传代至38代，作为工作细胞库（working cell bank,WCB）。MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测。结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞，且未发现突变、缺失等情况，无其他种属DNA污染。MCB及WCB细胞生长状态良好，生长曲线呈“S”型，倍增时间分别为27.78及27.21 h；细菌、真菌及支原体检查均为阴性；细胞形态、结构及细胞膜完整，膜上微绒毛较多，表明细胞状态好，不同细胞代次之间差异较小；具有成瘤性，但不具有致瘤性；染色体2 n=(78±2)条占比为86%～96.19%,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定；对流感病毒较敏感。结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养，并建立了悬浮细胞系MDCK-S。本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础。
2024年08期 v.37 921-931页 [查看摘要][在线阅读][下载 1425K] [下载次数：105 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：16 ] - 宋月娟;杨波;冯强生;哈小琴;
目的 探讨肠道菌群代谢产物氧化三甲胺（trimethylamine oxide,TMAO）对人肾小球系膜细胞HMC和肾小管上皮细胞HK-2核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路的影响，为通过肠道菌群治疗和预防肾损伤提供理论依据。方法 用TMAO处理HMC和HK-2细胞，并设未处理或TMAO处理0 h对照组，Real-time PCR法检测炎性反应因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β基因mRNA的转录水平，Western blot法检测NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的表达。并用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理HMC和HK-2细胞，验证TMAO的促炎作用。结果 与对照组相比，HMC和HK-2细胞TMAO处理组炎性反应因子MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1β mRNA转录水平均明显上升（t=33.349,P=0.001）,TMAO对两种细胞有明显的促炎作用；TMAO可激活HMC和HK-2细胞的NF-κB及MAPK信号通路，引起炎性反应，造成对肾脏的损伤。结论 TMAO含量的增高可激活HMC和HK-2细胞NF-κB/MAPK信号通路，刺激两种细胞释放炎性反应因子，从而导致肾损伤的发生和发展。
2024年08期 v.37 932-937页 [查看摘要][在线阅读][下载 881K] [下载次数：163 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 严皎;白红妹;杨旭;孙文佳;龙琼;马雁冰;
目的 探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)在过敏原引起的哮喘气道炎症和重塑中的作用及其靶向干预的治疗潜能。方法 以呈现TGF-β2肽表位的乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）/TGF-β2病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）免疫6只雌性BALB/c小鼠，ELISA法检测小鼠血清中TGF-β2特异的IgG应答，细胞试验检测抗体对TGF-β2活性的中和能力。卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）短期刺激诱导急性气道过敏性炎症，细胞试验检测小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中TGF-β活性水平；ELISA法检测小鼠血清中OVA特异的IgE水平；光学显微镜下进行BALF中炎性细胞总数及分型计数，并用ELISA法检测BALF中细胞因子水平。经OVA慢性刺激诱导气道纤维化，肺组织切片Masson’s trichrome检测胶原积累，并用Sircol胶原检测试剂盒进行可溶性胶原含量定量分析。结果 VLPs免疫诱导了TGF-β2特异性IgG应答，抗血清可有效中和TGF-β2活性。小鼠急性气道过敏性炎症模型中，VLPs免疫下调了气道活性TGF-β水平，显著促进了血清中OVA特异性IgE产生，对气道以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润显示抑制作用，显著促进了Th2炎性细胞因子在气道中的积累。慢性肺纤维化模型中，VLPs免疫显著下调了肺组织胶原沉积及可溶性胶原水平。结论 HBcAg/TGF-β2 VLPs免疫是调控TGF-β2作用的有效手段，TGF-β2在过敏原诱导的炎症应答中总体显示抑制作用，但在纤维化中发挥促进作用。
2024年08期 v.37 938-944+951页 [查看摘要][在线阅读][下载 1018K] [下载次数：88 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 谢涛;孙青;彭秀娥;张朝;张宽;王翠;刘伯宁;李文宾;姚兵;
目的 通过无血清悬浮驯化CHO-K1细胞，筛选出单克隆源性可追溯、生长状态良好的宿主细胞株，并进行表达验证。方法 采用逐步降低血清含量的方法，将贴壁状态的CHO-K1细胞驯化成适应无血清培养基培养的悬浮细胞；通过单细胞接种/成像系统Verified In-Situ Plate Seeding（简称VIPS系统）筛选单克隆，经连续培养综合评估单克隆细胞的倍增时间、结团率、细胞直径等参数，确定候选克隆；将候选克隆分别转染携带绿色及红色荧光蛋白的质粒，根据荧光蛋白表达情况确定1株克隆作为工程细胞株的宿主细胞。结果 驯化获得的CHO-K1细胞适应无血清悬浮培养，倍增时间为20～24 h；通过单克隆筛选和产量评估确定的单克隆细胞株单克隆源性良好且可追溯，以0.5×10~6个/mL的细胞密度接种，培养7 d最高细胞密度可达8.27×10~6个/mL，活率不低于80%，平均倍增时间20.31 h，能较好地表达外源基因。结论 通过无血清驯化培养，成功获得单克隆源性可追溯、生长状态良好且能够用于蛋白高表达的CHO-K1细胞株。
2024年08期 v.37 945-951页 [查看摘要][在线阅读][下载 993K] [下载次数：122 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：13 ] - 李攀;刘术敏;刘晓雅;程英杰;吴常伟;黄恩启;
目的 获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒（norovirus,NV）P蛋白，并分析其抗原特性。方法 通过优化合成GⅡ.2[P16]型NV P蛋白基因并克隆至pET-28a（+）载体上，构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a，转化DH5α感受态细胞，通过对表达菌种的优化，使P蛋白以可溶性形式表达。表达的P蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后，采用Western blot法检测纯化蛋白抗原性；体积排阻高效液相色谱（size exclusion high performance liquid chromatography,SECHPLC）法检测抗原纯度；ELISA法鉴定抗原抗体结合能力。结果 重组BL21 Star(DE3)pLySs工程菌目的蛋白以可溶形式高表达，经亲和层析纯化后，GⅡ.2 P蛋白纯度为95.53%，且抗原性较好。结论 用原核表达菌种成功制备了可溶性表达的NV P蛋白，并明确了P蛋白的抗原性，为GⅡ.2[P16]型NV检测试剂盒和重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。
2024年08期 v.37 952-956页 [查看摘要][在线阅读][下载 837K] [下载次数：175 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：8 ]
- 王小鑫;王丽丽;张益国;高姣;马磊;张婷婷;陈国柱;
目的 建立一种快速、简单且高效提取细胞培养上清中外泌体的方法，以期促进外泌体在临床与疾病治疗中的应用。方法 将羟基（OH）修饰磁珠与高分子化合物Buffer EXD结合，建立新的外泌体提取系统，并使用该系统提取细胞培养上清中的外泌体。通过Western blot法检测外泌体标志蛋白的表达变化；纳米颗粒追踪分析（nanoparticles tracking analysis,NTA）技术检测外泌体的粒径大小和浓度；透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）技术检测外泌体的形态结构。对Buffer EXD系统提取外泌体的方法进行优化（提取pH、Buffer EXD比例、孵育时间、磁珠用量及种类）。结合细胞培养和显微拍照技术分析新系统纯化的外泌体对A549细胞增殖的影响。结果 新系统提取的外泌体样品中标志蛋白Alix、CD9和CD81等表达水平较高，而外泌体阴性蛋白Calnexin表达较少；新系统提取的外泌体粒径峰值在100 nm左右，具有茶托状的典型形状。新系统的pH为5.0,Buffer EXD浓度为20%,1.75%的OH磁珠与样品孵育时间为40 min时，提取的外泌体样品中标志蛋白含量最高。新系统提取的外泌体对A549细胞的增殖具有明显的促进作用。结论 以OH修饰的磁珠为介质，结合高分子化合物Buffer EXD，成功建立了一种可快速、简单、高效地从细胞上清中提取结构完整、形态特征明显且具有生物学功能外泌体的新体系。
2024年08期 v.37 975-982+988页 [查看摘要][在线阅读][下载 1024K] [下载次数：271 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：15 ] - 刘洪涛;孙跃秋;王冲;王梦涵;张树杰;李航;庞惠娟;徐俊峰;张夫坤;
目的 制备水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus,VZV）收获物，纯化后免疫日本大耳白兔，制备VZV抗血清，并进行各项检定。方法 将VZV Oka株（vOka）在人二倍体细胞2BS株中传代培养，病毒收获后经超速离心纯化，制备免疫原，与弗式佐剂混合后经背部多点注射免疫雌性日本大耳白兔5只，制备VZV抗血清。Western blot检测血清抗体的特异性；测定膜抗原荧光抗体（fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA）效价和血清抗体中和效价，并对两种检测方法的结果进行相关性分析。利用抗体效价较高的血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒进行异种病毒干扰试验。结果 制备的VZV抗血清可特异性结合vOka和Oka-7S病毒收获物及gE和ORF7蛋白等多种VZV抗原；3免血清FAMA抗体效价可达1∶16 384，血清抗体中和效价达1∶256；根据Karl Pearson相关系数分析得出两种检测方法结果呈线性相关。异种病毒干扰试验中试验组与对照组病毒滴度差值均<0.50 lgCCID50/mL，表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒滴度均无干扰。结论 成功制备了特异性强，亲和力高的VZV抗血清，为VZV成分疫苗的检定奠定了基础。
2024年08期 v.37 983-988页 [查看摘要][在线阅读][下载 921K] [下载次数：69 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：12 ] - 肖萌;万莹铚;张宏岐;邹坤;李啸;邹华蓉;邓锐;
目的 采用Plackett-Burman实验和响应面法（response surface methodology,RSM）优化酵母源无血清培养基（serum-free medium,SFM）的营养组分，明确培养基成分及浓度。方法 以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）为研究对象，在实验室前期筛选出的SFM的基础上，采用Plackett-Burman实验对10种营养组分进行筛选。筛选出对细胞具有促生长作用的因素后，利用RSM进行二次优化，以阐明各变量间的相互作用，确定促CHO细胞生长的最佳培养基组成。取对数生长期CHO细胞，用优化后的培养基重悬后，进行传代扩增。结果 经Plackett-Burman实验筛选的10个变量中，酵母抽提物（yeast extract,YE）FM888和微量元素能有效提高细胞比生长速率；非必需氨基酸和FM888对提高细胞存活天数作用显著；FM888、必需氨基酸、非必需氨基酸及微量元素能显著提高活细胞密度。综合选择FM888、微量元素和非必需氨基酸3个因素进行RSM优化试验。优化后的培养基悬浮培养CHO细胞时，其最大比生长速率可达0.025/h，存活天数可达6 d，最大活细胞密度可达7.187×106个/mL。将优化后的培养基进行细胞稳定传代试验，可稳定传代12代，其活细胞密度及细胞活率与对照组（商业化SFM）接近。结论 成功获得成分明确且能支持CHO细胞高密度生长的酵母源SFM，为YE在动物细胞培养中的应用以及高效SFM的开发提供了参考和依据。
2024年08期 v.37 989-995+1001页 [查看摘要][在线阅读][下载 1475K] [下载次数：282 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：14 ] - 孙瑞欣;彭炳淮;刘冰莹;杨健;殷婷婷;孙嘉鑫;富锐丽;
目的 建立反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）法测定人干扰素α2b(human interferon alpha 2b,hIFNα2b)原液中三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）的残留量，并进行验证及初步应用。方法 液相色谱条件为：ZORBAX 300SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）；流动相0.08%磷酸（pH 3.0）+5.0%甲醇溶液；检测时间6 min；流速0.8 mL/min；柱温35℃；紫外检测器波长210 nm；上样量20μL；等度洗脱。对方法进行系统适应性、线性、专属性、准确性、精密性、定量限与检测限及耐用性验证。同时采用建立的方法和复合型色谱柱Comixsil ACRP(100 mm×4.6 mm,5μm)测定3批hIFNα2b原液样品的TFA残留量。结果 TFA在10～300μg/mL范围内线性关系良好（R~2=0.998 4）；平均加标回收率为101.8%,RSD为2.68%；重复性和中间精密度验证的RSD分别为0.46%和0.45%；定量限为10μg/mL，检测限为2μg/mL；有机溶剂、缓冲盐pH与柱温箱温度在规定条件下轻微上下浮动对检测结果无明显影响，检测波长变化时峰面积会受到影响。采用2种方法检测3批hIFNα2b原液中TFA残留量，结果均未检出。结论 建立的RP-HPLC法具有较好的系统适应性、专属性、准确性、精密性及耐用性，可用于hIFNα2b原液中TFA残留量的测定。
2024年08期 v.37 996-1001页 [查看摘要][在线阅读][下载 838K] [下载次数：68 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：12 ]