- 管亚博;邢坤鹏;刘晨阳;王颖;杜翔宇;陈娜娜;张朔;孙宏亮;李景良;
目的 探讨汉坦病毒(Hantataan virus,HTNV)PS-6株经乳鼠鼠脑传代后在Vero细胞上的适应性,并筛选出适应Vero细胞的高滴度HTNV。方法 将HTNV PS-6株在乳鼠鼠脑内连续传代培养后,Vero细胞上连续传10代,观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并采用蚀斑法检测病毒感染性滴度,滴度升高后,采用蚀斑克隆纯化筛选单克隆病毒并检测病毒滴度;分别以0.01、0.05、0.1 MOI感染Vero细胞后绘制病毒生长曲线;Reed-Muench法计算病毒LD50;Western blot法鉴定病毒特异性;透射电镜观察病毒大小及结构;与HTNV PS-6株全基因组核苷酸序列及氨基酸序列进行比较分析。将筛选出的Vero细胞适应株V-PS-6经腹腔注射10只BALB/c雌性小鼠,濒死时解剖,取心、肝、脾、肾、脑、肺、小肠、肌肉等组织进行免疫组化分析。结果 鼠脑传代毒株对Vero细胞具有较好适应性,初始病毒滴度为1.3 lgPFU/mL,随着传代次数增加,病毒滴度逐渐升高,稳定在7.5～7.9 lgPFU/mL;筛选出的适应株V-PS-6蚀斑边界清晰、圆润、肉眼可见,大小如针尖,LD_(50)为10-~(7.8),在相对分子质量约50 000处可见特异性蛋白条带,大小与适应前HTNV PS-6株相符;V-PS-6病毒直径为80～210 nm,与HTNV PS-6电镜结构未见明显差异,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为98.85%;V-PS-6病毒明显分布在小鼠肾脏、肝脏、小肠、后腿肌肉及心脏中。结论 成功筛选出1株可较好适应Vero细胞的高滴度HTNV株,且具有良好的遗传稳定性,为后续HTNV Vero细胞疫苗的研发及相关机制的研究奠定了基础。
2024年07期 v.37 779-787页 [查看摘要][在线阅读][下载 1253K] [下载次数：60 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：9 ] - 王文伟;蔡蓓蓓;楼觉人;
目的 利用毕赤酵母重组表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后免疫小鼠,检测制备的HPV58 L1 VLPs的免疫原性。方法 构建HPV58 L1多拷贝表达质粒,转化KM71巴斯德毕赤酵母,筛选高表达毕赤酵母工程菌,5 L发酵罐发酵,分离纯化HPV58 L1 VLPs。纯化后的HPV58L1 VLPs以不同剂量经腹腔免疫雌性BALB/c小鼠80只,4周后采用半数有效剂量(median effective dose,ED_(50))评价其免疫效果。结果HPV58 L1表达质粒经酶切鉴定构建正确,Western blot分析、氨基酸序列测定和透射电镜观察结果显示,HPV58 L1蛋白可在毕赤酵母中成功表达并可自发组装成直径约50 nm的VLPs,经离子交换和体积排阻层析纯化,可获得纯度95%以上的HPV58 L1 VLPs。纯化后的HPV58 L1 VLPs在小鼠模型上的ED_(50)为0.009μg。结论 利用毕赤酵母成功制备了具有良好免疫原性的HPV58 L1 VLPs。
2024年07期 v.37 788-794页 [查看摘要][在线阅读][下载 980K] [下载次数：115 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：11 ] - 姚永鹏;张子昌;许可;朱慧;李松;王基宏;魏鑫;黄杰;
目的 制备新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体（cross-reacting material 197,CRM197）结合疫苗，并评价其免疫原性，以期为流行性脑脊髓膜炎的防控奠定基础。方法 用1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP）分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基，并以己二酸二酰肼（adipic acid dihydrazide,ADH）作为连接剂与活化多糖通过氰酸酯连接，生成裸露酰肼基的多糖-ADH衍生物，再通过4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基吗啉盐酸盐[4-（4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl）-4-methyl morpholinium chloride,DMTMM]与CRM197生成酰胺键偶联，得到各单价结合物原液，并进行相关检测。将单价结合物原液按一定比例混合后，分别加入3种冻干保护剂（蔗糖溶液、乳糖溶液及蔗糖+甘露醇溶液），经冻干，制备3种ACYW135-CRM197结合疫苗。将制备的疫苗于0、14 d经雄性NIH小鼠背部皮下注射，0.2 mL/只，每组10只，并于初次免疫后21 d，经小鼠颌下静脉采血，分离血清，ELISA法检测特异性抗体水平。结果 A、C、Y、W135-CRM197单价结合物原液的检测结果均符合质量标准。ACYW135-CRM197疫苗成品可与各群多糖抗血清形成明显沉淀线；平均分子量均在1 680 000～5 230 000范围内。3种ACYW135-CRM197结合疫苗的抗A、C、Y、W135群多糖IgG抗体阳转率均为100%;ACYW135-CRM197（蔗糖）、ACYW135-CRM197（乳糖）和ACYW135-CRM197（蔗糖+甘露醇）组比较，差异均无统计学意义（t=0.249～1.157,P均> 0.05）。结论 本研究制备了新型ACYW135-CRM197结合疫苗，且该疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性。
2024年07期 v.37 795-800页 [查看摘要][在线阅读][下载 911K] [下载次数：88 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：9 ] - 张秋菊;杨雪;冯子祎;赵博;林洪娟;田丽媛;杨光;刘畅;李子莉;孙宏亮;
目的 对冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液（无人白）体积分子排阻-高效液相色谱（size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC）主峰右侧峰2蛋白进行鉴定，以明确该峰的蛋白成分，保证疫苗质量。方法 将冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液（无人白）进行SEC-HPLC分析，收集主峰右侧峰2，经超滤浓缩后，进行二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）还原、碘代乙酰胺（iodoacetamide,IAM）烷基化和胰蛋白酶（Trypsin）酶解，产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果 冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液（无人白）SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白，单个蛋白匹配肽段数在59～79个之间；单个蛋白匹配特征肽段种数在6～12种之间；单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20～36次之间；鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%～64.31%之间。参与统计的肽段共280个，质谱偏差均小于0.15 Da。结论 冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液（无人白）SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV，为疫苗颗粒解离物。
2024年07期 v.37 801-805页 [查看摘要][在线阅读][下载 869K] [下载次数：57 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：10 ] - 王天松;杨媛;姚思;杨雨欣;王婧;张炜;万巧凤;
目的 评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性,以期为该疫苗的研发提供实验依据。方法 将重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a经双酶切和测序鉴定后,转染CHO-K1细胞,采用Western blot法检测融合蛋白Ag85B-Fc2a的表达。将载体pcDNA3.1(+)及重组质粒pcD-Ag85BFc2a经大腿肌内分别注射雌雄C57BL/6J小鼠(对照组及免疫组),每组10只,初次免疫后2周进行加强免疫。初次免疫后14、28及42 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清中IgG抗体效价;初次免疫后42 d,无菌取小鼠脾脏,制备为单细胞悬液,采用流式细胞术检测CD4~+及CD8~+T细胞比例;初次免疫后42 d,经尾静脉注射M.tb H37Ra,10~6 CFU/只,攻毒28 d后,断颈处死小鼠,无菌分离小鼠肺脏及脾脏,采用平板法检测左侧肺脏及脾脏荷菌数,金胺O荧光染色法检测右侧肺脏的荷菌情况。结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a构建正确,转染CHO-K1细胞后,可检测到相对分子质量约70 000的融合蛋白Ag85B-Fc2a。初次免后14、28、42d,免疫组小鼠血清Ag85B特异性IgG抗体效价分别为1:3 200、1:12 160、1:12 800,对照组小鼠血清中均未检测到抗体效价。初次免疫后42 d,对照组及免疫组小鼠脾脏中CD4+T细胞比例分别为(23.61±0.64)%及(26.92±0.80)%,CD8~+T细胞比例分别为(14.12±0.87)%及(18.78±0.94)%,差异均有统计学意义(t分别为3.23和3.64,P均<0.05)。M.tb H37Ra感染28 d,对照组及免疫组小鼠左侧肺脏荷菌数分别为(4.73±0.13)及(3.81±0.14) CFU,脾脏荷菌数分别为(5.02±0.19)及(4.30±0.13) CFU,差异均有统计学意义(t分别为4.65和3.12,P均<0.01);右侧肺脏荷菌情况与左侧一致。结论 Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内可诱导特异性体液及细胞免疫效应,对M.tb H37Ra感染可产生良好的保护力。
2024年07期 v.37 806-810+816页 [查看摘要][在线阅读][下载 978K] [下载次数：72 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 魏国良;朱婧靓;沈雪;李晶晶;赵淑双;邵宏秋;张芸畅;修华谦;王梦舒;徐娜;石亮;马霄;
目的 评价3种软件对吸附无细胞百白破联合疫苗效价检测结果统计的影响，以期为日常检测中分析软件的选择提供依据。方法 采用《中国药典》三部（2020版）中规定的方法检测吸附无细胞百白破联合疫苗百日咳、破伤风及白喉效价。应用PLA 3.0、Stati及依据《中国药典》三部（2020版）通则1431编制的Excel计算表3种软件对吸附无细胞百白破联合疫苗效价检测数据进行统计，并计算效价相对值；应用质反应平行线法确定上述数据的95%可信限区间，并计算相对偏差。结果 3种软件统计吸附无细胞百白破联合疫苗百日咳效价相对值为99.16%～100.46%,95%置信区间相对偏差均<3%；破伤风效价相对值为99.67%～100.46%,95%置信区间相对偏差均<1%；白喉效价相对值为97.33%～100.03%,95%置信区间上限相对偏差均<0，但95%置信区间下限相对偏差较大。结论 3种软件可相互替代，其中Stati及通则软件适合部分无审计追踪要求的工作场景，PLA 3.0软件适合生物制品企业的质量控制体系应用。
2024年07期 v.37 811-816页 [查看摘要][在线阅读][下载 882K] [下载次数：47 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：10 ]
- 陈倩;冯增强;谭琳;饶彩霞;张炯炯;赵静;唐秋萍;
目的 探讨亚甲蓝光化学法（methylene blue photochemistry,MB-P）病毒灭活对血浆外泌体微小RNA(microRNA,miRNA)表达的影响，以期为MB-P病毒灭活血浆的质量控制提供新的参考指标。方法 收集2021年7月—2022年4月采集的健康无偿献血者全血11人份。离心获得血浆，同一人份新鲜血浆分为2份，分别制备为新鲜冰冻血浆（fresh frozen plasma,FFP）和MB-P病毒灭活血浆。采用差速离心法提取血浆中的外泌体，通过透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）仪对提取的外泌体进行鉴定，并利用芯片技术检测外泌体miRNA的表达谱。采用qRT-PCR法对差异表达的4个miRNA进行验证，生物信息学方法预测差异表达miRNA的靶基因，并对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析。结果 提取的两组囊泡状物质的形态特征及直径大小均符合外泌体特征。与对照组比较，MB-P组血浆外泌体中存在14个差异表达的miRNA，其中6个miRNA表达上调，8个miRNA表达下调。qRT-PCR验证结果与芯片表达趋势一致。差异表达的miRNA靶基因涉及DNA结合、离子结合、催化活性等功能，并参与核酸代谢、生物合成、转录调控等多种生物学过程；富集显著的功能通路与病毒感染性疾病、肿瘤、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等密切相关。结论 MB-P病毒灭活血浆和FFP外泌体miRNA存在差异性表达，血浆外泌体miRNA有望成为MB-P病毒灭活血浆质量评价的潜在参考指标。
2024年07期 v.37 817-823页 [查看摘要][在线阅读][下载 1220K] [下载次数：38 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 何振虎;赵克学;谢晶莹;冯若飞;
目的 探讨跨膜蛋白43(transmembrane protein 43,TMEM43)在脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）感染过程中的作用。方法 采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）高通量蛋白质组学技术，对EMCV感染的BHK-21细胞进行蛋白质组学分析；采用分子克隆技术构建人源TMEM43重组质粒p CMV-MycTMEM43，转染HEK293细胞后，感染EMCV(MOI=3),real-time PCR法检测TMEM43过表达对EMCV体外增殖以及EMCV吸附和进入的影响；RNAi试验筛选最有效干扰序列，转染HEK293细胞后，感染EMCV(MOI=3),real-time PCR法检测TMEM43下调对EMCV体外增殖的影响。结果 EMCV感染的BHK-21细胞TMEM43表达显著增加。重组质粒p CMV-Myc-TMEM43可在HEK293细胞正常表达，TMEM43过表达对EMCV复制有显著促进作用，病毒感染滴度也有一定提高；TMEM43过表达在病毒进入阶段发挥促进作用，而对吸附过程无任何影响。TMEM43下调对EMCV增殖有明显抑制作用。结论 TMEM43促进EMCV复制增殖，主要在病毒进入阶段发挥作用。
2024年07期 v.37 824-830页 [查看摘要][在线阅读][下载 1078K] [下载次数：29 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：4 ] - 张沐捷;梁嘉欣;肖承东;吴红;刘晨飞;张艳玲;彭亮;
目的 评价波形蛋白（vimentin,Vim）在B族链球菌（group B streptococcus,GBS）引发新生儿脑膜炎中的作用，并探讨其作用机制，以期为新生儿GBS脑膜炎预防和治疗提供实验依据。方法 以人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell,HBMEC）为细胞模型，通过转染Vim小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列，构建HBMEC的Vim抑制株，同时设转染NC siRNA组（转染阴性对照序列），Western blot及免疫荧光法检测Vim抑制效果。转染48 h后，按MOI=100感染GBS，分别于感染2和3 h进行黏附及侵袭试验；感染3 h后，采用Western blot及免疫荧光法检测抑制Vim对HBMEC中NF-κB p65核转位的影响；Western blot法检测抑制Vim对HBMEC内ERK通路激活相关蛋白及炎性因子表达水平的影响。结果 与转染NC siRNA组比较，转染Vim siRNA1组HBMEC中Vim蛋白表达水平及荧光强度均显著降低（t分别为3.242和71.51,P分别<0.05和<0.001）。与NC siRNA+GBS组比较，Vim siRNA+GBS组黏附率及侵袭率均显著降低（t分别为9.949和30.050,P均<0.001）；磷酸化p65水平显著下降（t=2.824,P <0.05）,p65蛋白的核转位现象受到抑制，核内绿色荧光强度大幅下降；TNF-α、IL-6、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)蛋白水平受到显著抑制（t分别4.000、6.367、3.872,P均<0.05）。结论 抑制Vim可减少GBS对HBMEC的黏附及侵袭，抑制NF-κB及ERK信号通路的激活及下游炎性因子的产生，从而减少GBS对HBMEC的损伤。
2024年07期 v.37 831-836+842页 [查看摘要][在线阅读][下载 1112K] [下载次数：43 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 李舒月;张浩;张雄洲;赵云汉;杨建林;曹春雨;吕亚丰;
目的 原核表达、纯化腺相关病毒9(adeno-associated virus 9,AAV9)衣壳可变区蛋白，并制备针对AAV9衣壳可变区的兔多克隆抗体。方法 设计并合成编码AAV9衣壳蛋白可变区的DNA序列，插入原核表达载体pET-30a获得质粒pET-30a-AAV-VR，转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达多价抗原肽，在变性条件下经Ni-NTA树脂纯化，透析复性后将AAV9可变区蛋白免疫雄性日本大耳白兔，制备多克隆抗体，间接ELISA法检测抗体效价，Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体的特异性。结果 表达AAV9衣壳可变区蛋白的重组原核表达质粒pET-30a-AAV-VR经XhoⅠ和BglⅡ双酶切鉴定构建正确。表达的蛋白相对分子质量约为20 000，纯化后可被His标签抗体识别。制备的兔多克隆抗体效价为1∶10 240 000，能特异性识别AAV9衣壳蛋白。结论 成功表达了AAV9衣壳可变区蛋白，并制备了高效价的兔多克隆抗体，为后续AAV载体开发以及AAV生物学功能研究奠定了基础。
2024年07期 v.37 837-842页 [查看摘要][在线阅读][下载 928K] [下载次数：257 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ]