- 韩越;田莉;杨盼;刘乐乐;赵忠欣;王铁成;郑学星;郑文文;
目的 通过9型腺相关病毒（adeno-associated virus 9,AAV9）系统表达发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）Gn蛋白，并评价其免疫原性。方法 将SFTSV Gn基因重组至病毒载体pAAV-CMV-FH，将构建的重组质粒转染HEK293T细胞，获得重组病毒AAV9-Gn；免疫荧光和Western blot法鉴定Gn蛋白的表达情况。将18只雌性BALB/c小鼠随机分为Mock组（无血清DMEM）、AAV9-GFP组（1×1011vg）和AAV9-Gn组（1×1011vg），各组均经小鼠右后肢肌内注射，100μL/只。连续21 d监测各组小鼠体质量、饮食、行为及精神状态，并计算体质量变化率；于免疫后2、4、8、16周，采用荧光灶减少中和试验（fluorescent reduction neutralization test,FRNT）检测各组小鼠血清中SFTSV中和抗体水平，ELISA法检测AAV9-Gn组小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平。结果 与特异性抗体孵育显色后，转染AAV9-Gn的Vero细胞于荧光显微镜下可见特异性绿色荧光，且可与小鼠抗SFTSV Gn单克隆抗体发生特异性结合，并于相对分子质量约61 000处可见特异性结合条带。3组小鼠体质量均呈增长趋势，组间差异无统计学意义（F=0.158～2.621,P> 0.05），且饮食、行为及精神状态均表现正常。免疫后2、4、8和16周，AAV9-Gn组小鼠血清中的SFTSV中和抗体效价均明显高于Mock组和AAV9-GFP组（H=13.332～14.538,P均<0.001），且效价峰值出现在第8周；不同时间点小鼠血清中特异性IgG1抗体水平均明显高于IgG2a(F=4.373～12.975,P均<0.05)。结论 通过AAV9表达系统可正确表达SFTSV Gn蛋白，且对小鼠毒性较低，并具有良好的免疫原性，有望作为SFTSV疫苗的候选成分。
2024年03期 v.37 267-272页 [查看摘要][在线阅读][下载 930K] [下载次数：187 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 饶金瑞;王永红;沈智勇;赵黎明;
目的 分析高浓度重链抗体可变区-Fc(variable domain of heavy-chain antibody-Fc,VHH-Fc)融合蛋白稳定性的影响因素。方法 设置振摇、光照、40℃高温3组强制降解试验，通过差式扫描荧光法、动态光散射法（dynamic light scattering,DLS）和超高效液相色谱-质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS）法检测3种强制降解条件对高浓度VHH-Fc融合蛋白构象稳定性、胶体稳定性、平均水化动力学直径及翻译后修饰的影响。结果 光照条件下，高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象展开起始温度（onset temperature of unfolding,T_(onset)）、熔解温度（melting temperature,T_m）和起始聚集温度（aggregation onset temperature,T_(agg)）降低幅度最大，Met160和Met266处的氧化比例大幅增加；振摇条件下，扩散相互作用系数（diffusion interaction parameter,k_D）和平均水化动力学直径变化量最大。结论 光照会显著降低高浓度VHH-Fc融合蛋白的构象稳定性并诱导甲硫氨酸氧化，振摇对其胶体稳定性影响最为显著且会促进聚集。
2024年03期 v.37 273-279页 [查看摘要][在线阅读][下载 928K] [下载次数：120 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 吴清胜;李媛媛;姚春萍;
目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域（receptor binding domain,RBD）、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体（R319-K537串联）3种蛋白的基因序列，按照N-端信号肽序列不同[内源（Endo）、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同，分为25组。通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒，建立25组三级毒种库。将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞（2.8×10~6个/mL）和对数生长中期细胞（1.2×10~7个/mL）。将各组病毒培养至100 mL(500 mL摇瓶)，进行蛋白表达，并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测。S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组，进行重复验证。结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞，分泌表达量未提高，接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异。A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高，A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组；C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag)。分别选择每种蛋白表达量较高的2组（A4、A9;B4、B6;C3、C4）进行重复验证确定，结果显示，A4、B6、C4的分泌表达量最高。结论 S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同，是GP67信号肽，而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽。表明N-端序列会影响蛋白的分泌，信号肽序列有一定的通用性，但也与要表达的目的蛋白序列有关。
2024年03期 v.37 280-286页 [查看摘要][在线阅读][下载 1089K] [下载次数：217 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 黄莉;周艾玲;李雨桐;王紫薇;徐昊;钱明明;周崇;
目的 构建表达禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）σC蛋白的重组腺病毒载体pAd-σC，并检测其对肝癌细胞增殖的影响，为新型抗肿瘤疫苗的研发奠定基础。方法 采用PCR法扩增ARVσC基因，构建重组穿梭载体pShuttle-σC，随后转化含有腺病毒载体pAdessy-1的BJ5183感受态细胞，通过同源重组获得重组腺病毒载体pAd-σC，在HEK293细胞内包装病毒，TCID50法检测病毒滴度，Western blot和ELISA法检测σC蛋白的表达，CCK-8法检测病毒对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响。结果 重组穿梭载体pShuttle-σC经双酶切及测序鉴定证明构建正确，重组腺病毒载体pAd-σC经菌落PCR鉴定证明构建正确；σC蛋白在肝癌细胞SMMC7721中可成功表达；重组腺病毒Ad-σC效价为10~(7.5)/0.1 mL，可抑制肝癌细胞SMMC7721增殖。结论 成功构建了含有ARV σC基因的重组腺病毒载体pAd-σC，初步分析其对肿瘤细胞增殖具有抑制作用，为揭示ARV溶瘤效应的分子机制及进一步研发新型抗肿瘤生物制剂奠定了基础。
2024年03期 v.37 287-291+297页 [查看摘要][在线阅读][下载 914K] [下载次数：184 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘煜菡;张名;郭伟;冯昌增;许丹菡;马绍辉;
目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒，设计针对CVA16全VP1基因序列引物，采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序；利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株，其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析，发现3株B1a和17株B1b基因亚型；其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%，与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%，与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B1b分离株与其他3株B1a的核苷酸和氨基酸同源性为87.4%～88.4%和97.3%～98.7%。结论 2019年昆明地区流行的CVA16属于B1a和B1b基因亚型，以B1b为主，且均为中国大陆流行株。
2024年03期 v.37 292-297页 [查看摘要][在线阅读][下载 1024K] [下载次数：107 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]
- 牟韶璐;范家琛;崔灿;张曦;许运斌;
目的 制备狂犬病病毒（rabies virus,RV）基质蛋白（M）鼠源和兔源多克隆抗体，并比较其反应原性。方法 以RV CVS-11毒株感染细胞后的cDNA为模板构建原核表达载体pET-28a-M，转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白，经镍柱亲和层析、透析复性后，免疫雌性BALB/c小鼠和雌性新西兰大白兔，取全血，分离血清，ELISA法检测鼠源和兔源多克隆抗体效价，Western blot法、间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）、免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）法检测鼠源和兔源多克隆抗体反应原性。结果 质粒pET-28a-M经测序鉴定证明构建正确；制备的鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1∶100和1∶256 000，与不同RV毒株均具有反应原性。结论 成功制备了M蛋白鼠源和兔源多克隆抗体，为探讨M蛋白与宿主蛋白相互作用的关系以及研究RV的致病机制提供了重要的生物学工具。
2024年03期 v.37 310-315页 [查看摘要][在线阅读][下载 883K] [下载次数：312 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 王光裕;杨靖清;魏长龙;周泽鑫;杨志行;黄钰;周勇;
目的 制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品，以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法 使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA，以其为标准物质原料，采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和含量筛选，随后稀释至浓度约为100 ng/μL后，按160μL/支进行分装。组织5家不同实验室，采用紫外分光光度法进行协作标定，并评价其稳定性和适用性。结果 制备的HEK293细胞DNA国家标准品经检测，A_(260)/A_(280)均在1.8～2.0之间，电泳图谱为单一条带，符合规定。该标准品经5家实验室协作标定，共得到78个有效数据，平均含量为104.8 ng/μL，相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为4.2%，均数的95%可信区间为103.8～105.8 ng/μL，单次测定的95%参考值范围为96.0～113.6 ng/μL，平均可信限率为1.0%，推荐保存条件为-80℃。采用2个不同型号的荧光定量PCR仪进行适用性研究，该标准品在0.3～3 000 pg/反应范围内适用性良好，扩增效率分别为101%和95%，标准曲线R2分别为0.999 2和0.999 5。结论 该批HEK293细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求，可作为国家标准品用于荧光定量PCR检测，含量定为104.8 ng/μL，批号为270039-202301。
2024年03期 v.37 316-321页 [查看摘要][在线阅读][下载 925K] [下载次数：149 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 王新竹;赵丹华;苏歧;刘欣玉;姜崴;叶强;
目的 建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法，并对方法进行验证，以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法 筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量，建立SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法，并进行验证。结果 筛选到1种对各变异株S蛋白均能良好结合的试剂盒，并确定了转染细胞为HEK293T、细胞铺板浓度为2.5×10~5个/mL、转染剂量为6孔板4μg/孔，建立了通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法。验证结果显示，该方法能满足检定需求。结论 建立的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法相对准确度、线性、中间精密度、范围良好，可用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。
2024年03期 v.37 322-328页 [查看摘要][在线阅读][下载 872K] [下载次数：209 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 蔡丽星;李翱翔;张琳;沈培玉;张坤明;邱建华;
目的 建立帕博利珠单抗电荷异构体阳离子交换高效液相色谱（cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC）检测方法，并进行验证。方法 采用MabPac SCX-10色谱柱将帕博利珠单抗与交换柱基质结合，通过逐渐增加流动相盐浓度洗脱带不同电荷的异构体，并验证该方法的专属性、精密性、线性范围、准确性和耐用性。采用建立的方法对3批帕博利珠单抗成品的电荷异构体进行检测。结果 帕博利珠单抗最后1个酸性异构体峰和第1个碱性异构体峰与主峰的分离度分别为1.28和1.42。流动相A和制剂缓冲液在样品出峰处无明显干扰峰；精密性验证RSD均<2.0%；标准品总峰面积、主峰面积、酸性异构体峰面积和碱性异构体峰面积均与其理论浓度呈良好的线性关系，R~2均为1.00;3个浓度标准品的总峰面积和主峰面积的回收率为96.81%～106.07%；流动相pH在6.30±0.10范围内，标准品总峰面积和主峰面积百分比RSD分别为1.5%和1.9%；色谱柱温度在（35±4）℃范围内，标准品总峰面积和主峰面积百分比RSD分别为0.4%和0.3%。3批帕博利珠单抗成品主峰保留时间RSD为0。结论建立的CEX-HPLC法能够有效分离帕博利珠单抗的酸性异构体、主峰及碱性异构体，具有良好的专属性、精密性及准确性，可用于帕博利珠单抗的后续研发、扩大生产的工艺检定及稳定性研究。
2024年03期 v.37 329-334+342页 [查看摘要][在线阅读][下载 907K] [下载次数：138 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 孙锈锈;徐逸梦;周宇荀;李凯;肖君华;
目的 建立细胞培养液中常见细菌和真菌的多重荧光定量PCR检测方法，并进行验证。方法 选取金黄色葡萄球菌NUC基因、生孢梭菌COLA基因和白色念珠菌ITS-2区段基因，分别设计1组引物及探针，并以辣椒UBI3基因作为外标基因，建立金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和外标基因的三重反应体系及白色念珠菌和外标基因的两重反应体系。验证方法的引物特异性、线性范围、检测限、专属性、抗干扰性和精密性。采用建立的方法对100份293T细胞培养液样本进行检测，同时与普通PCR法进行比较。结果 3对引物于不同退火温度（56、57、58、59℃）下均可扩增出对应3种菌约100 bp的特异性基因条带，大小与预期相符；3种菌标准品质粒在5.80×10~6～5.80×10~2copies/μL范围内，与Ct均呈良好的线性关系，标准曲线方程分别为：Y=-3.373 X+37.48、Y=-3.557X+36.59、Y=-3.536 X+39.78,R~2均> 0.99，扩增效率均在90%～110%范围内；3种菌的检测限均为10~1CFU/mL;3种菌的引物及探针在易发生交叉反应的6种细胞基因组DNA上无特异性扩增；293T细胞、酵母菌、大肠埃希菌、支原体的基因组DNA对检测无影响；重复性和中间精密性验证CV均<15%。100份细胞培养液样本中，检出14份阳性及86份阴性样本，随机挑选的3个阳性和2个阴性样本普通PCR法检测结果与建立的方法一致。结论 建立的用于检测细胞培养液中细菌、真菌的多重荧光定量PCR法具有良好的专属性、抗干扰性和精密性，且简便易操作、成本低、灵敏度高，可快速检测细胞培养过程中的污染情况。
2024年03期 v.37 335-342页 [查看摘要][在线阅读][下载 1112K] [下载次数：636 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 岑丽航;孙鸽云;王珍珍;肖瑞琳;王丽丽;常冰梅;
目的 优化构树叶黄酮类物质的提取工艺，并探讨黄酮类物质对小鼠表皮干细胞的抗氧化作用。方法 采用单因素试验优化构树叶黄酮类物质提取工艺中的液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1）、NaOH浓度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)、浸提温度（60、65、70、75、80℃）。在单因素试验结果的基础上，以黄酮类物质质量分数为评价指标，采用正交试验设计确定最佳提取工艺。免疫磁珠法分选CD49f~+/CD71~-小鼠表皮干细胞，并检测黄酮类物质对其细胞相对活力及细胞中还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的影响。结果 黄酮类物质提取工艺的最佳条件为：液料比30∶1、NaOH浓度0.6%、pH4.5、浸提温度75℃。最佳条件下提取黄酮类物质平均质量分数为1.47%。与阴性对照组比较，当黄酮类物质终浓度为25及50μg/mL时，细胞相对活力明显增加（F分别为1.427和13.747,P均<0.01）；当黄酮类物质终浓度为12.5、25、50μg/mL时，GSH含量明显上升（F分别为0.044、0.291和2.577,P均<0.05）,MDA含量明显下降（F分别为3.568、4.909和1.400,P均<0.05）。结论 优化后的构树叶黄酮类物质提取工艺稳定可靠，有利于构树叶加工后剩余原液的再利用，提取的黄酮类物质可促进小鼠表皮干细胞增殖，具有抗氧化性。
2024年03期 v.37 343-349+355页 [查看摘要][在线阅读][下载 991K] [下载次数：627 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 宋欣然;张茗婧;伊丽男;彭少丹;王帆;张国强;司伟雪;朱涛;
目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗），建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法，并进行验证及应用。方法 采用传统方法，用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件，建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法，并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL，酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应，而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应；建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间；PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%；酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%；该方法的灵敏度为20.719 ng/mL，检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取样时间点的35批样品，其抗原含量变化均符合脱毒反应变化趋势。结论 成功制备了PT兔多抗，并建立了精密性和准确性良好的定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法，可用于组分百白破联合疫苗生产过程中化学脱毒样品的抗原含量检测。
2024年03期 v.37 350-355页 [查看摘要][在线阅读][下载 858K] [下载次数：390 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 刘玉国;罗惠瑜;林凤涓;王洁娴;莫嘉琦;苏楚红;陈俊斌;郑钟黛西;查龙应;
目的 分离纯化小鼠原代腹腔巨噬细胞分泌的外泌体并进行鉴定。方法 分别经5只雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐肉汤，灌洗获得小鼠原代腹腔巨噬细胞后，用流式细胞术分析纯度。采用ExoQuick TC外泌体试剂盒提取小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体，BCA试剂盒测定外泌体蛋白含量，透射电镜观察外泌体形态，纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径及分布，Western blot法检测外泌体标志物（CD9、CD63和TSG101）的表达。结果 每只小鼠可获得约5×10~6个纯度为（99.17±0.65）%的腹腔巨噬细胞。5 mL小鼠原代腹腔巨噬细胞培养上清液中可提取869μg外泌体蛋白。小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体在电镜下呈折光性较强的典型茶托样囊泡，高表达外泌体特异性标志物TSG101、CD63和CD9，粒径分布集中在100～200 nm，平均粒径为175.2 nm。结论 腹腔注射巯基乙酸盐肉汤可提高小鼠原代腹腔巨噬细胞得率，ExoQuick TC外泌体试剂盒能够提取足量且纯度较高的小鼠原代腹腔巨噬细胞外泌体。
2024年03期 v.37 356-360页 [查看摘要][在线阅读][下载 946K] [下载次数：575 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]