- 刘鹏;彭岳;
目的 构建人程序性死亡受体配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)免疫球蛋白可变区（immunoglobulin variable region,IgV）结构域基因酵母双杂交重组诱饵质粒，检测其在酵母中的表达情况，检测PD-L1 IgV蛋白细胞毒性和自我激活，以及PD-L1 IgV与人硫氧还蛋白（human thioredoxin,hTrx）之间的相互作用情况。方法 利用生物信息学方法对人PD-L1进行分析，并根据NCBI GenBank数据库中登录的PD-L1基因编码区序列设计扩增PD-L1 IgV结构域的引物，以pENTER-PD-L1质粒为模板进行PCR扩增，克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7。将鉴定正确的重组诱饵质粒及pGBKT7空载体分别转化至Y2HGold酵母细胞，PCR及Western blot法检测PD-L1 IgV基因及蛋白的表达；同时检测PD-L1 IgV蛋白毒性及自我激活效应，并采用滴板法检测诱饵蛋白PD-L1 IgV与hTrx相互作用情况。结果 PD-L1的生物信息学分析结果与相关报道一致；成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV，并获得Y2HGold阳性克隆子，PD-L1 IgV能在其中稳定表达。空载体pGBKT7、重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长良好，菌落大小、数量一致，呈白色，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上两者均不生长，表明PD-L1 IgV蛋白对酵母无毒性且无自我激活效应；滴板法试验结果显示，所有实验组在SD/-Trp/-Leu平板上生长良好，仅阳性对照组可在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上生长且呈蓝色，表明诱饵蛋白PD-L1 IgV、hTrx不存在自我激活现象，且两者之间也不存在相互作用。结论 成功构建了重组人PD-L1 IgV酵母双杂交诱饵质粒，PD-L1 IgV蛋白对酵母细胞无毒性且无自我激活效应，且与hTrx之间无相互作用。后续可利用hTrx构建肽适体文库，从中筛选可与PD-L1 IgV特异结合的肽适体。
2024年01期 v.37 8-16页 [查看摘要][在线阅读][下载 1169K] [下载次数：157 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 谢晓丹;韩瑞;卜倩倩;李梦璐;张亚楠;黄赛亚;皇甫辉;
目的 探讨靶向沉默CXCL5对喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）AMC-HN-8细胞相关生物学功能的影响，并通过TCGA数据库进行相关的调控分析。方法 在TCGA数据库中获取LSCC相关RNA-seq数据，分析CXCL5基因在LSCC及其癌旁组织中的表达差异；选取2019年1月—2020年12月山西医科大学第一医院60例LSCC及其癌旁组织样本，采用免疫组织化学染色法检测LSCC组织中CXCL5蛋白的表达；培养人LSCC细胞系AMCHN-8,qPCR法检测AMC-HN-8细胞中CXCL5 mRNA转录水平；筛选敲降效率较高的2组siRNA,CCK8法检测细胞增殖情况，Transwell试验检测细胞侵袭、迁移情况，流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况；通过ssGSEA分析CXCL5与LSCC肿瘤免疫浸润水平的相关性，构建CXCL5共表达基因网络并对其进行GO和KEGG富集分析。结果 与癌旁组织及对照组细胞相比，CXCL5在LSCC组织及细胞中表达均升高，与TCGA数据库分析一致；在AMC-HN-8细胞中抑制CXCL5表达，具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的能力，通过G1期抑制细胞周期，促进其凋亡；在DC、中性粒细胞（neutrophils）、NK和TH17免疫细胞评分存在差异。结论 CXCL5基因在LSCC组织中高表达，可能是LSCC靶向治疗的靶点之一。
2024年01期 v.37 17-25页 [查看摘要][在线阅读][下载 1350K] [下载次数：109 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 马春英;赵蕾;王子凡;侯刚;马花;马忠仁;王家敏;
目的 探讨不同片状载体的表面特性及对不同细胞的培养效果。方法 选择3种片状载体（A、B、C），对其材料进行化学元素组成分析，对经0.1 mol/L NaOH溶液预处理前后的载体进行接触角检测。通过测定Vero、MDCK和MRC-5细胞在3种载体上的贴附效果和葡萄糖消耗量，并利用荧光染色法观察细胞生长状态，比较3种载体的细胞贴附率和培养效果。结果 3种载体均主要由C、H、O 3种元素组成，且含有少量的N和S元素。预处理前，载体B的接触角为0°，显著低于载体A[(109±3.13)°]和C[(121±6.82)°]（F均为709.1,P均<0.000 1），亲水性较强，载体A和C亲水性较差；预处理后，3种载体表面的接触角均为0°，差异无统计学意义（F=0.069 4,P> 0.05），均亲水。培养3 h内，3种载体的细胞贴附率均在80%以上，细胞在载体纤维上均致密，长势均匀，葡萄糖消耗量曲线均趋于“S”型，细胞连续培养效果良好。葡萄糖消耗总量载体A与C基本一致，载体B低于A和C。结论 对3种片状载体的化学元素组成和亲疏水特性关系进行了分析，并对Vero、MDCK和MRC-5 3种细胞的贴附率及培养效果进行了评价，为片状载体的后续研究及生产应用提供了参考。
2024年01期 v.37 26-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 1057K] [下载次数：155 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 唐琪;刘宏博;张哲罡;张家友;曹慧;杨晓明;
目的 利用真核生物mRNA成熟过程中内含子外显子置换（permuted intron exon,PIE）策略，构建可在体外环化（in vitro cyclization,IVC）并具有翻译功能的RNA，转染HEK-293T细胞后进行表达。方法 选取具备Ⅰ型催化内含子（groupⅠcatalytic intron）的5'和3'环化臂、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）以及目的基因序列构建模板质粒，通过PCR法获得线性化质粒模板，经体外转录（in vitro transcription,IVT）合成线性RNA，依次添加环化试剂完成IVC得到环状RNA(circular RNA,circRNA)。采用琼脂糖凝胶电泳及核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化的方式确认RNA环化。将分别携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,Fluc）及流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）(IVR-180)的circRNA转染HEK-293T细胞，逐一验证其体外表达情况。结果 RNA环化后电泳主条带变小，且出现环化产生的小片段，经RNase R消化，仅环化后RNA条带仍有部分保留。转染EGFP-circRNA的HEK-293T细胞荧光显微镜下可见明显绿色荧光；转染Fluc-circRNA的HEK-293T细胞Fluc表达值平均为未环化RNA的20倍以上，且随Fluc-circRNA转染剂量的升高，荧光数值（relative light unit,RLU）呈上升趋势；Western blot分析显示，转染HAcircRNA的HEK-293T细胞成功表达了HA蛋白。结论 在体外成功环化了线性RNA并完成不同蛋白的表达，为新型流感疫苗及mRNA疫苗的研究奠定了基础。
2024年01期 v.37 32-36页 [查看摘要][在线阅读][下载 975K] [下载次数：312 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 张宗欣;赵纪元;孙红宾;
目的 在E.coli中表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）分子伴侣Acr2蛋白，并分析其功能。方法 将重组质粒pET-28a-Acr2转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达His-Acr2蛋白，经Ni-NTA层析及SuperdexTM200 10/300 GL凝胶过滤层析纯化获得Acr2蛋白。将Acr2蛋白经热变性（100℃温浴15 min）及化学变性（8 mol/L尿素，37℃温浴4 h）后进行自发再折叠和再组装的复性处理，采用圆二色性光谱法和非变性SDS-PAGE检测变性及复性后Acr2蛋白的二级结构。通过底物结合试验检测Acr2蛋白在体外的分子伴侣功能。结果 纯化Acr2蛋白的相对分子质量约为232 000，纯度达90%以上，浓度约为2 mg/mL。Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然二级结构，且在48℃条件下可与变性的苹果酸激酶（malate dehydrogenase,MDH）形成稳定复合物。结论 Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然分子构象，且具有体外分子伴侣活性。本研究为制备具有天然活性的结核杆菌蛋白抗原提供了新策略。
2024年01期 v.37 37-42页 [查看摘要][在线阅读][下载 935K] [下载次数：125 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 胡金瑞;樊莎莎;孙佳;王维;杨勇;王智欣;刘超锋;庞敏;王海龙;
目的 研究ANKRD49(ankyrin repeat domain 49)对人肺腺癌细胞NCI-H1299迁移能力的影响及其机制。方法将携带ANKRD49基因的慢病毒载体及针对ANKRD49的shRNA感染NCI-H1299细胞，构建稳定过表达与敲低ANKRD49的细胞模型，同时分别构建感染空白序列慢病毒载体和无意义shRNA序列慢病毒载体的对照细胞模型。采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测ANKRD49 mRNA和蛋白表达水平；细胞划痕试验检测ANKRD49对细胞迁移能力的影响；实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2/9及基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloprotease,TIMP）-1/2 mRNA及蛋白表达水平；Western blot法检测p65、p-p65、IκBα和p-IκBα蛋白表达水平。结果 ANKRD49过表达组细胞中ANKRD49 mRNA和蛋白水平均显著高于对照组（t分别为70.02和45.68,P均<0.001）。与对照组相比，ANKRD49过表达组细胞24和48 h的迁移能力明显升高（t分别为5.343和3.282,P分别为0.005 9和0.030 4）;MMP-2和MMP-9 mRNA转录水平及蛋白表达水平均明显升高（t分别为9.304和6.193,P分别为0.000 7和0.003 5）,TIMP-1和TIMP-2 mRNA转录水平及蛋白表达水平均明显下降（t分别为3.858和3.517,P分别为0.018 2和0.024 5）,MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-2值明显升高（t分别为17.7和9.682,P分别<0.001和<0.01）;p-p65和p-IκBα蛋白表达水平明显升高，p65和IκBα总蛋白水平无明显变化，p-p65/p65、p-IκBα/IκBα值明显增高（t分别为3.962和5.370,P分别为0.016 7和0.005 8）。ANKRD49敲低后结果均与过表达结果相反。结论 ANKRD49通过激活NF-κB/p65信号通路增加MMP-2/9的表达及提高MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2值来促进NCI-H1299细胞的迁移。
2024年01期 v.37 43-50+64页 [查看摘要][在线阅读][下载 1317K] [下载次数：106 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ]
- 邵天舒;李潇;李玉立;赵璇;梅婕;何欢;李文东;
目的 建立疫苗中铝佐剂含量的高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）测定方法，并进行验证及初步应用。方法 采用8-羟基喹啉衍生化方法进行测定。色谱柱为苯基-己基色谱柱[Luna 5u Phenyl-Hexyl(250 mm×4.6 mm)]，流动相为乙酸铵-8-羟基喹啉乙腈溶液（60∶40），并添加终浓度为20 mg/L的抗坏血酸，荧光检测器激发波长380 nm，发射波长520 nm，流动相流速为1.0 mL/min，柱温为40℃，进样量为50μL，等度洗脱。对方法的专属性、线性范围、准确性、重复性、稳定性和耐用性进行验证。采用建立的方法测定12批疫苗中的铝含量，并与《中国药典》三部（2020版）通则3106的滴定法测定结果进行比较。结果 样品色谱图中无干扰色谱峰，非铝佐剂疫苗成分、磷酸盐缓冲液对测定均无干扰。铝标准品在6.25～100μg/mL浓度范围内线性关系良好，r=0.999 6；准确性验证试验中甲型肝炎灭活疫苗、重组乙型肝炎疫苗、吸附无细胞百白破疫苗及肠道病毒71型灭活疫苗铝含量平均加样回收率分别为98.32%、100.85%、101.09%和99.31%;4种疫苗同批次平行6份供试品溶液中铝含量检测结果的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）分别为1.09%、1.42%、0.97%和1.30%;4种疫苗样品溶液室温放置0、2、4、6、8 h，铝含量检测结果的RSD分别为0.82%、0.73%、0.40%和0.48%；流动相中乙酸铵溶液与8-羟基喹啉乙腈溶液比例在±5%范围改变时，4种疫苗铝含量测定结果波动范围均不超过2%。建立的HPLC法测定12批疫苗样品中铝含量结果与《中国药典》三部（2020版）滴定法结果无明显差异。结论 成功建立了疫苗中铝佐剂含量HPLC测定方法，该方法专属性、线性、准确性、重复性、稳定性、耐用性良好，操作简便且自动化程度高，人为因素干扰少，可实现单支样品测定，为快速大批量测定疫苗成品中铝含量，以及生产过程中监控半成品分装提供了有效手段。
2024年01期 v.37 58-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 873K] [下载次数：213 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：3 ] - 何鹏;王玲;张娜;张霖阳;吕溪琳;李世慧;
目的 建立百日咳黏附素（pertactin,PRN）等电点（isoelectric point,pI）全柱成像毛细管等电聚焦电泳（whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF）检测方法，并进行验证。方法 通过优化检测PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数，建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法，并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证。结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min；体系中PRN抗原最佳终浓度为300μg/mL。PRN抗原pI约为6.035，样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰，方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好。结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析，可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考。
2024年01期 v.37 65-71页 [查看摘要][在线阅读][下载 978K] [下载次数：180 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 张慧;高文丽;李凤智;胡加亮;李剑;
目的 采用SYBR GreenⅠ染料建立实时定量PCR法检测CHO细胞外源抗体轻链（light chain,LC）、重链（heavy chain,HC）基因拷贝数，并进行方法的验证及初步应用。方法 以CHO细胞中稳定表达的B2m(β2-microglobulin)基因作为内参基因，分别设计适宜的LC和HC基因引物及内参基因引物，确定实时定量PCR方法的反应体系和反应程序。对建立的方法进行特异性、线性、精密性及耐用性验证，并采用建立的方法检测重组细胞株工作细胞库（WCB）及不同传代次数细胞中LC和HC基因拷贝数。结果 外源基因与内参基因引物可特异性结合目标片段；B2m、LC、HC基因引物扩增效率分别为106.7%、106.3%和99.1%，线性方程相关系数均大于0.99，具有良好的线性关系；精密性验证的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均小于1%；短时间内少次冻融对检测结果影响较小。利用建立的方法检测不同代次重组细胞株LC和HC基因拷贝数，未见明显变化。结论 成功建立了CHO细胞外源基因拷贝数实时定量PCR检测方法，该方法特异性、线性、精密性及耐用性良好，为其他CHO细胞株表达的外源基因拷贝数检测提供了参考。
2024年01期 v.37 72-78页 [查看摘要][在线阅读][下载 937K] [下载次数：295 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 郭莎;贾哲;龙彩凤;黄璟;贺鹏飞;高洁;于传飞;徐刚领;刘万卉;王兰;
目的 建立基于U937-NF-κB-Luc细胞系的阿达木单抗生物学活性快速检测方法，并进行验证。方法 以U937-NF-κB-Luc细胞系为效应细胞，通过荧光素酶发光原理建立阿达木单抗生物学活性检测方法，并优化方法的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度（以160 ng/mL为初始浓度，进行2倍系列稀释，共10个稀释度）、抗体起始浓度（起始终浓度设为2 000 ng/mL，进行2倍系列稀释，共20个稀释度）、抗体稀释倍数（1.5、2、3、4倍）、细胞接种量（8×10~3、2×10~4、4×10~4、6×10~4个/孔）、孵育时间（0.5、1、2、3 h），验证方法的专属性、准确性、精密性及线性范围。采用优化的方法及基于L929细胞的TNF-α中和活性法分别检测5批阿达木单抗的相对效价。结果 阿达木单抗国际标准品的剂量-效应曲线呈典型的S型，且所得数据符合四参数方程式：y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,R~2> 0.99。确定最适TNF-α浓度为5 ng/mL，抗体起始浓度为800 ng/mL，抗体稀释倍数为2倍，细胞接种量为2×10~4个/孔，诱导时间为2 h。阿达木单抗等3种TNF-α靶点的治疗性单抗均可获得较好的剂量-效应曲线，其他非TNF-α靶点的治疗性单抗未呈现该曲线；效价理论值对数与其实测值对数的直线回归方程的斜率为1.037，相对偏倚均在±12%范围内；各效价样品的相对效价测定值的几何变异系数（geometric coefficient of variation,GCV）均<20%；理论效价在64%～156%范围内，与检测值呈良好的线性关系，拟合直线回归方程为y=1.037 4 x-0.023 7,R~2=0.998 4。两种方法检测5批阿达木单抗的相对效价检测结果差异无统计学意义（t=1.198,P=0.265 1）。结论 建立的基于U937-NF-κB-Luc细胞系的阿达木单抗生物学活性检测方法具有良好的专属性、准确性及精密性，且耗时短（仅需3 h），可作为阿达木单抗生物学活性的快速评价方法。
2024年01期 v.37 79-85页 [查看摘要][在线阅读][下载 984K] [下载次数：148 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ] - 金丽婷;黄岳;张素勤;肖文俊;朱克骏;张健;江秋虹;
目的 建立检测重组结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法，并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验，将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析，摸索最适检测条件，并依据《中国药典》四部（2020版）9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%～95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时，各评价指标结果均较好，在该检测条件下线性相关系数（R2）为0.998 5，线性范围为1.8～4.2μg；重复性RSD为0.01%；中间精密度RSD为0.16%；在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法，该方法专属性强，精密度、耐用性好，可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。
2024年01期 v.37 86-91页 [查看摘要][在线阅读][下载 856K] [下载次数：165 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：0 ]